邢 磊 焦穎華 耿麗華 孫 堯 (河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，河北 唐山 063000)

骨質(zhì)疏松(OP)作為中老年人群多發(fā)疾病之一，嚴(yán)重威脅老齡人口健康的同時(shí)也帶來了沉重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔1〕。目前對于OP的臨床治療一線藥物多為骨吸收抑制劑〔2〕，隨著祖國醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，包括仙靈骨葆在內(nèi)的多種中藥制劑在臨床和基礎(chǔ)研究中均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)骨形成的作用〔3〕，但具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，本研究旨在通過血清學(xué)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、生物力學(xué)等檢測指標(biāo)，探討仙靈骨葆對去卵巢OP大鼠模型的治療作用及其作用機(jī)制，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 仙靈骨葆(貴州同仁堂)，ELISA免疫試劑盒(上海史瑞可生物科技有限公司)。3月齡SD雌性大鼠24只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供，動物合格證號SCXK(京)2002-0003號，平均體重(275±15)g。動物于清潔級動物室飼養(yǎng)，自由進(jìn)食消毒顆粒，飲消毒水，單籠飼養(yǎng)。室溫(22±1)℃，濕度(67±5)%，定期紫外線消毒。

1.2 動物分組及處理 所有大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只:正常對照組(N)、去卵巢骨質(zhì)疏松模型組(OVX)、仙靈骨葆藥物治療組(XLGB)。OVX的制備:采用 1%戊巴比妥鈉以40 mg/kg體重的劑量腹腔注射麻醉，背側(cè)入路，以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm處取縱行切口，長約1 cm，暴露腹腔卵巢并予以切除后，以絲線將殘端結(jié)扎，逐層關(guān)閉傷口。

將仙靈骨葆用雙蒸水溶解成懸濁液，以灌胃針灌胃(250 mg·kg－1·d－1)，OVX 組給予等量雙蒸水灌胃，持續(xù)8 w，留取血、尿(24 h)后處死所有大鼠，取其左側(cè)完整的股骨、脛骨備行骨密度及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測量。

1.3 血、尿骨代謝指標(biāo)的檢測 所有大鼠處死前留取24 h尿液，再分別抽取外周血2 ml，采用ELISA法檢測血Ⅰ型前膠原氨基端前肽(PINP)值、尿脫氧吡啶諾啉排泄率(DPYD/Cr)和尿Ⅰ型膠原氨基末端肽排泄率(NTX/Cr)值。

1.4 骨密度(BMD)檢測 應(yīng)用Norland-XR36雙能X線骨密度測量儀(DEXA，美國)，測量大鼠左側(cè)股骨BMD。依據(jù)骨密度測量儀實(shí)際掃描測量的股骨長度，均分為4等分，上1/4為近端(pBMD)，中1/2為中段(mBMD)，下1/4為遠(yuǎn)端(dBMD)。

1.5 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)骨標(biāo)本制作和測量方法 骨組織不脫鈣制片，取大鼠右側(cè)股骨下端，經(jīng)固定、脫水、甲基丙烯酸甲酯包埋、不脫鈣切片后，行Von Kossa及Giemsa染色。用 Leica DMLB2熒光/光學(xué)顯微鏡及Leica DC300數(shù)碼攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與攝取圖像。

骨計(jì)量學(xué)測量指標(biāo)及方法:骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的動態(tài)和靜態(tài)參數(shù)在股骨遠(yuǎn)端干骺端生長板下1～4 mm范圍內(nèi)的次級松質(zhì)骨中測量，分內(nèi)、中、外三點(diǎn)隨機(jī)選取圖像錄入微機(jī)，每個(gè)標(biāo)本采用兩種觀察方法，每種9個(gè)圖像(組織學(xué)觀察用Giemsa染色、普通光源;類骨質(zhì)觀察用von Kossa染色)，然后采用Leica QWin多功能彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測定。

1.6 三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn) 取所有大鼠的右側(cè)股骨行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距(L)為20 mm，中央垂直(股骨與載荷成90°角)施加載荷，速率10 mm/min，在軟件里直接得到最大載荷(FM)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，資料用t檢驗(yàn)來處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果 OVX組血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr值顯著高于N組，XLGB能顯著降低血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr值，但仍顯著高于N組(均P＜0.05)。見表1。

表1 血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr水平( ± s，n=8)

表1 血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr水平( ± s，n=8)

與N組比較:1)P＜0.05;與OVX組比較:2)P＜0.05，下表同

組別PINP(μg/ml)DPYD/Cr(nmol/mmol)NTX/Cr(nmol/mmol)0.148±0.031 1.620±0.514 5.211±0.912 OVX組 0.339±0.0621) 3.865±0.7211) 8.974±1.1281)XLGB組 0.241±0.0451)2)2.609±0.5971)2)6.743±1.1851)2)N組

2.2 BMD檢測結(jié)果 OVX組大鼠股骨全長，近端、遠(yuǎn)端BMD均顯著低于N組，XLGB組近端和遠(yuǎn)端BMD顯著高于OVX組。見表2。

表2 BMD檢測結(jié)果(g/mm3， ± s，n=8)

表2 BMD檢測結(jié)果(g/mm3， ± s，n=8)

組別0.010 OVX組 0.189±0.0121)0.188±0.0101)0.185±0.0181)0.198±0.0121)XLGB組 0.203±0.0141)0.206±0.0131)2)0.198±0.0161)0.217±0.0091)2)tBMD pBMD mBMD dBMD N組 0.238±0.011 0.229±0.017 0.249±0.015 0.243±

2.3 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果 N組骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)顯著高于OVX、XLGB組，骨小梁分離度(Th.Sp)及骨吸收周長百分?jǐn)?shù)(Er.Pm)、破骨細(xì)胞數(shù)(Oc.No/Tb.Ar)、類骨質(zhì)周長百分?jǐn)?shù)(O.Pm)顯著低于OVX、XLGB組。XLGB組BV/TV、骨小梁厚度Tb.Th、熒光標(biāo)記周長比L.Pm(%)、骨形成率(BFR/BV)顯著高于OVX組，Th.Sp、Er.Pm、Oc.No/Tb.Ar顯著低于OVX組。見表3。

表3 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果( ± s，n=8)

表3 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果( ± s，n=8)

指標(biāo) N組 OVX組 XLGB組BV/TV(%) 30.85±4.78 15.22±5.011) 24.20±4.661)2)Tb.Th(μm) 87.64±10.66 58.96±8.951) 73.39±7.821)2)Tb，N(#/mm) 2.15±0.40 1.88±0.19 2.05±0.44 Tb，Sp(μm) 425.11±98.79 883.52±149.891)691±138.561)2)%L.Pm(%) 9.46±2.02 11.66±2.18 14.81±1.861)2)BFR/BV(%/年)41.17±8.26 50.60±10.77 66.77±12.301)2)Er.Pm(%) 10.04±2.12 22.28±5.011) 15.48±3.391)2)O.Pm(%) 14.22±4.48 20.41±5.081) 24.19±6.681)Oc.N(#/mm2) 0.07±0.04 0.34±0.111) 0.16±0.071)2)

2.4 生物力學(xué)檢測結(jié)果 三點(diǎn)彎曲檢測股骨最大載荷結(jié)果:N組 108.64±14.58，OVX組 111.75±16.82，XLGB組106.91±11.40，各組間比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

骨轉(zhuǎn)換水平增高是絕經(jīng)后OP的骨代謝特點(diǎn)。Ⅰ型膠原衍生自Ⅰ型前膠原，是礦化骨中惟一的膠原類型，其含量占骨有機(jī)基質(zhì)的90%，PINP即Ⅰ型前膠原氨基端前肽，是成骨細(xì)胞合成并釋放出Ⅰ型前膠原的細(xì)胞外分解產(chǎn)物，PINP在血液中的含量主要反映骨轉(zhuǎn)換的情況和Ⅰ型膠原的合成速率，升高提示骨轉(zhuǎn)換活躍，Ⅰ型膠原合成速率加快。目前認(rèn)為PINP是新骨形成的特異性的敏感指標(biāo)〔4〕，而且穩(wěn)定性較高，所以PINP是診斷OP的敏感生化指標(biāo)〔5〕。DPYD是近年來推出的反映骨吸收的一個(gè)生化指標(biāo)，主要來自骨骼，僅存于骨的Ⅰ型膠原中〔6〕，可顯示全身骨質(zhì)流失的情況。在臨床檢驗(yàn)中，為去除尿液濃縮稀釋對尿DPYD的影響，通常用尿DPYD/Cr表示。NTX是Ⅰ型膠原降解產(chǎn)生的交聯(lián)物的一部分，骨吸收時(shí)釋放入血，部分出現(xiàn)于尿液中，是特異的反映骨吸收狀態(tài)的指標(biāo)。在對OP的診斷及其并發(fā)癥預(yù)測等方面均有參考價(jià)值〔7〕。

本研究中去卵巢組上述骨代謝指標(biāo)均顯著升高，呈高骨轉(zhuǎn)換模型，與臨床女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)相似。而仙靈骨葆可降低其骨轉(zhuǎn)換水平，使骨代謝維持在更穩(wěn)定的水平。

目前OP的臨床治療尚無理想藥物，臨床應(yīng)用最為廣泛的骨吸收抑制劑亦有其局限和不足〔8〕。雖然以基因治療為代表的以促進(jìn)骨形成為靶向的新的治療方法已逐漸成為研究熱點(diǎn)，但多因“非單一骨靶向作用”限制了其臨床應(yīng)用〔9〕。因此，目前對OP的藥物治療仍有待完善，以仙靈骨葆為代表的中藥制劑已逐漸在臨床應(yīng)用中得到重視。本研究提示仙靈骨葆可部分阻止去卵巢大鼠骨量丟失，其機(jī)制與降低骨轉(zhuǎn)換水平，抑制骨吸收的同時(shí)促進(jìn)骨形成有關(guān)進(jìn)而維持骨量有關(guān)。

本研究中去卵巢大鼠表現(xiàn)出骨量下降，同時(shí)骨代謝狀態(tài)指標(biāo)提示骨吸收和骨形成活躍的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，與血、尿中骨代謝指標(biāo)結(jié)果一致。仙靈骨葆可部分阻止骨量丟失，同時(shí)骨吸收指標(biāo)顯著下降，骨形成指標(biāo)則顯著上升。脛骨近段與股骨遠(yuǎn)端的共同點(diǎn)是松質(zhì)骨含量較高，因此BMD與骨組織形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果均提示短期應(yīng)用仙靈骨葆治療大鼠OP的作用以松質(zhì)骨骨量改善更為明顯。生物力學(xué)結(jié)果提示去卵巢大鼠股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性并未顯著下降，仙靈骨葆組大鼠亦無顯著改變，結(jié)合以往研究，OP大鼠股骨發(fā)生組織學(xué)改變的同時(shí)內(nèi)徑增大，抗彎能力相對增加，抵消了組織學(xué)退變導(dǎo)致的力學(xué)特性改變。綜上，本研究提示仙靈骨葆灌胃給藥可通過促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，增加去卵巢大鼠骨量，減少其骨量丟失。

1 Compston J.Osteoporosis:social and economic impact〔J〕.Radiol Clin North Am，2010;48(3):477-82.

2 Dominguez LJ，Scalisi R，Barbagallo M.Therapeutic options in osteoporosis〔J〕.Acta Biomed，2010;81(S1):55-65.

3 Qin L，Zhang G，Hung WY，et al.Phytoestrogen-rich herb formula“XLGB”prevents OVX-induced deterioration of musculoskeletal tissues at the hip in old rats〔J〕.J Bone Miner Metab，2005;23(1):55-61.

4 Bauer DC，Garnero P，Harrison SL，et al.Biochemical markers of bone turnover，hip bone loss，and fracture in older men:the MrOS study〔J〕.J Bone Miner Res，2009;24(12):2032-8.

5 Burshell AL，Moricke R，Correa-Rotter R，et al.Correlations between biochemical markers of bone turnover and bone density responses in patients with glucocorticoid-induced osteoporosis treated with teriparatide or alendronate〔J〕.Bone，2010;46(4):935-9.

6 Yoon HK，Kim SW，Yim CH，et al.Metabolic characteristics and prevalence of osteoporosis among women in Tae-An area〔J〕.J Korean Med Sci，2001;16(3):323-7.

7 Wu N，Wang QP，Li H，et al.Relationships between serum adiponectin，leptin concentrations and bone mineral density，and bone biochemical markers in Chinese women〔J〕.Clin Chim Acta，2010;411(9-10):771-5.

8 Narongroeknawin P，Danila MI，Humphreys LG Jr，et al.Bisphosphonateassociated osteonecrosis of the jaw，with healing after teriparatide:a review of the literature and a case report〔J〕.Spec Care Dentist，2010;30(2):77-82.

9 Canalis E.Update in new anabolic therapies for osteoporosis〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2010;95(4):1496-504.