姜禮紅 裴立春 滕宗艷 孟 佳 宋芳芳 張一娜

(哈爾濱醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院老年病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

阿爾茨海默病(AD)是德國醫(yī)生于1896年發(fā)現(xiàn)的一種腦細胞逐漸減少的疾病，是導致癡呆的主要原因〔1〕。癡呆是一種與認知功能下降相關的癥候群，隨著人口老齡化進程的加快，AD發(fā)病率明顯呈上升趨勢，給家庭和社會帶來的負擔非常嚴重，引起了社會的廣泛關注〔2〕。AD發(fā)病機制中已經(jīng)被廣為接受的一種觀點是:腦中淀粉樣斑塊積聚是引發(fā)AD系列病理改變的觸酶〔3〕。越來越多的實驗已證明Aβ淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性可能是導致AD重要原因之一，那么尋找使Aβ減少的特殊藥物，則可稱之為一種“治本”的方法。胰島素作為一種激素，其發(fā)揮的血糖調(diào)節(jié)作用已為人們所知。已有研究證實，在大腦主要的認知功能區(qū)存在大量的胰島素受體，可以認為胰島素是通過刺激特定的中樞位點來調(diào)整記憶功能，腦室內(nèi)胰島素給藥能改善大鼠記憶的形成〔4〕。本實驗利用大鼠AD模型，采用皮下注射胰島素作為干預，對大鼠認知行為、病理以及海馬區(qū)Aβ1～40表達進行了觀察，為進一步探討胰島素對AD的作用，合理應用胰島素治療AD提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Aβ1～40(美國 Sigma公司提供)，大鼠腦立體定位儀(STW－1三維推進器，成都儀器廠)，臺式牙科鉆(307－6，上海齒科醫(yī)械廠)，電子嬰兒秤(ACS－20－YE，無錫市衡器廠)，微量進樣器(YY0088－92，寧波市鎮(zhèn)海三愛儀器廠)，數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(HH.W21.600S，上海躍進醫(yī)療器械廠)，Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)，攝影顯微鏡(OLYMPUS U－SPT型)，胰島素(批號:XV60220，諾和諾德制藥有限公司)，抗Aβ1～40多克隆抗體(美國Sigma公司提供)，免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

1.1.2 實驗動物分組 健康雄性Wistar大鼠(黑龍江省哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)，體重(300±20)g，分籠飼養(yǎng)，每籠8只，自由飲食，室內(nèi)常溫下配方料喂養(yǎng)，光照、黑暗各12 h。將大鼠隨機分為4組，每組8只:(1)正常對照組:不進行任何處置;(2)模型組:立體定向雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ1～40;(3)鹽水治療組:造模1 d后每日8點給予0.9%生理鹽水(1 ml/kg)腹部皮下注射，用藥21 d;(4)胰島素組:造模1 d后每日8點給予正規(guī)速效胰島素(0.1 U/kg)腹部皮下注射，用藥21 d，根據(jù)文獻〔5〕及預試驗結(jié)果選擇此給藥劑量，該劑量不會引起大鼠血糖下降，不影響相應檢測時間點大鼠的活動能力。術后14 d，4組分別作行為學檢測，術后21 d取腦做病理學觀察和免疫組化。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1～40的預處理 用無菌生理鹽水將Aβ1～40(美國Sigma公司提供)稀釋成2 μg/μl，置入電熱恒溫箱37℃孵育1 w，使其變?yōu)槟蹜B(tài)的Aβ1～40。

1.2.2 AD動物模型的復制〔6〕手術大鼠麻醉后，參照大鼠腦立體定位圖譜〔7〕，經(jīng)預實驗確定進針點(AP=3.0 mm，ML=2.0 mm，DV=4.0 mm)，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)緩慢注入凝聚態(tài) Aβ1～405 μl，5 min 內(nèi)注射完畢，留針 5 min 以保證溶液充分彌散。所有操作均在無菌條件下進行。

1.2.3 行為學檢測 水迷宮:平臺置于第Ⅲ象限的中間，在其他3個象限中任選一入水點，實驗每天訓練2次，每次采用不同的入水點，每次訓練2 min的方案。訓練5 d，分別記錄每只動物的潛伏期、游過的路程(定向航行實驗)以及在訓練的最后1 d，將平臺移走，分別用秒表記錄每只大鼠第一次經(jīng)過平臺的時間即測試潛伏期，并記錄每只大鼠在2 min內(nèi)經(jīng)過平臺的次數(shù)以及在平臺所在象限內(nèi)逗留的時間(空間探索試驗)，作為評價大鼠學習成績的指標。

1.2.4 病理學觀察 行為學測試后進行心血管灌注固定法。各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，先以冰生理鹽水100 ml快速灌注，再以4%多聚甲醛(4℃)150 ml灌注固定，冰臺快速取腦做冠狀切面，投入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)固定、石蠟包埋，連續(xù)冠狀組織切片，片厚5 μm，取海馬部位的切片裱于經(jīng)多聚賴氨酸處理的清潔玻片上，60℃烤箱內(nèi)烘烤2 h后放入4℃冰箱保存，分別行HE、剛果紅染色。

1.2.5 免疫組織化學檢查 免疫組化染色采用PV二步法，具體操作過程按試劑盒說明書進行。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.2.6 圖像分析 以海馬神經(jīng)細胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性結(jié)果。每組取8張腦片，每張細胞片在海馬CA1區(qū)針道附近隨機觀察5個具有代表性的中倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算出各個視野中陽性細胞數(shù)，由兩名人員獨立觀察，最后取平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行分析，所有數(shù)值以±s表示，逃避潛伏期采用重復測量方差分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 定向航行試驗 大鼠造模14 d后，用Morris水迷宮法檢測4組大鼠的定向航行、空間探索能力。定向航行試驗結(jié)果見圖1，4組的逃避潛伏期均不斷縮短。開始各組間無顯著差異，經(jīng)過5 d的訓練組間出現(xiàn)差異。正常組經(jīng)過5 d訓練潛伏期明顯縮短，說明這一組別有學習和記憶能力。胰島素組測試潛伏期與正常組相比無顯著差異(P＞0.05)，表明胰島素治療組有學習和記憶能力。與模型組和鹽水組相比差異顯著(P＜0.01)，但胰島素組的潛伏期明顯縮短可能是實驗例數(shù)較少的緣故。模型組與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)，表明模型組學習記憶能力受損。鹽水組和模型組相比無顯著差異，說明鹽水對AD模型影響不大。

2.2 空間探索試驗 在第5天撤去平臺，以大鼠穿越平臺次數(shù)及大鼠在第Ⅲ象限活動時間作為衡量記憶好壞指標，模型組穿越站臺次數(shù)比正常組少55%，模型組大鼠在第Ⅲ象限活動時間比正常組少40%，胰島素組與正常組比較無顯著差異(P＞0.05)，與模型組和鹽水組相比差異顯著(P＜0.01)。模型組和鹽水組與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)。見圖2。

2.3 Aβ1～40海馬注射后局部病理改變 光鏡下正常組大鼠海馬區(qū)未見神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元排列規(guī)則、緊密、形態(tài)完整。模型組及鹽水對照組大鼠海馬區(qū)注射點附近可見顆粒細胞帶明顯受損，局部神經(jīng)元大量缺失，細胞排列疏松紊亂，部分細胞缺失，注射點附近出現(xiàn)彌漫性膠質(zhì)細胞反應，細胞增生、聚集，核小深染，成扁圓形，判斷為膠質(zhì)細胞增生，錐體細胞數(shù)量較對照組明顯減少。胰島素注射組顆粒細胞帶輕度受損，神經(jīng)元排列尚規(guī)則，與模型組之間有明顯差異見圖3。剛果紅染色模型組可見細胞排列紊亂，胞漿內(nèi)可見深染，提示為淀粉樣蛋白聚集，正常組染色較淺，細胞排列規(guī)則，且胞漿未見異常改變，胰島素組染色較淺，細胞形態(tài)完整，接近正常組見圖4。2.4 海馬CA1區(qū)Aβ1～40的表達 模型組及鹽水對照組海馬CA1區(qū)可見大量棕褐色陽性細胞〔(57.53±2.99)和(58.10±4.26)〕，胞質(zhì)及軸突、樹突均清晰著色，正常組大鼠海馬CA1區(qū)偶見Aβ1～40免疫陽性神經(jīng)元(7.15±0.62);同擬AD模型組比較，胰島素組大鼠海馬 CA1區(qū)Aβ1～40免疫陽性神經(jīng)元明顯減少或消失(24.05±0.84，P＜0.01)，同正常組比較其他三組Aβ1～40免疫陽性神經(jīng)元明顯受損(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖1 大鼠空間定向航行能力

圖2 大鼠空間探索能力

圖3 各組海馬HE染色病理學圖片(×40)

圖4 各組海馬剛果紅染色病理學圖片(×40)

圖5 各組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ1～40表達(DAB，×40)

3 討論

AD是一種以慢性進行性記憶、認知等智能障礙為主要臨床表現(xiàn)、與增齡相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理變化是腦內(nèi)出現(xiàn)大量的因β－淀粉樣蛋白積聚所形成的老年斑、因tau蛋白異常磷酸化導致的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失等。海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是近記憶回路的重要結(jié)構(gòu)，是學習記憶的重要解剖基礎和神經(jīng)中樞，海馬結(jié)構(gòu)的序化板層構(gòu)筑和神經(jīng)元相對獨立分布等特點使其成為最理想的學習記憶的研究模型，海馬不同區(qū)域的功能不盡相同，其中CAl區(qū)在學習、記憶中擔負重要作用〔8〕，許多研究表明，海馬與機體衰老、AD及癲癇發(fā)作有著非常密切的關系〔9〕。

自從1978年在大鼠腦組織提取物中發(fā)現(xiàn)有胰島素存在的證據(jù)以來，相繼證實人類及哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛區(qū)域中存在胰島素及其受體，胰島素在神經(jīng)系統(tǒng)中有著特殊的生物學效應，在調(diào)節(jié)腦能量代謝，促進神經(jīng)生長發(fā)育，調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長活動和遞質(zhì)釋放等方面起著重要作用〔10～12〕。對人和動物的研究表明，當與認知有關的大腦皮層、海馬等部位得不到充分的胰島素或?qū)σ葝u素失去反應時，可發(fā)生記憶減退的輕型Alzheimer病〔13〕。對大鼠腦室內(nèi)注射鏈脲佐菌素以破壞IR，可造成嚴重的學習和記憶損傷〔14〕。

本實驗采用海馬微量注射凝聚態(tài)Aβ1～40的方法建立擬AD大鼠模型，對注射部位、注射量及注射藥物的孵化作了改進，本實驗評價學習記憶障礙的設備是帶攝像裝置及分析軟件的水迷宮，實驗數(shù)據(jù)不受人為因素影響，更客觀、真實可靠。

本實驗胰島素劑量選用0.1 U/kg皮下注射，參考相關文獻及預實驗結(jié)果，該劑量不會影響大鼠血漿血糖水平，但胰島素組大鼠出現(xiàn)毛色無光澤，且體重增長不明顯。同時為避免在行為學習時胰島素組出現(xiàn)高胰島素水平，因為胰島素有鞏固情感記憶的作用，因此給藥在行為學習之后進行。在過去研究中有的直接計算每天的平均逃避潛伏期后再進行t檢驗或方差分析，或根據(jù)大鼠的逃避潛伏期在定位航行試驗后3 d趨于穩(wěn)定的情況，僅對后3 d的平均逃避潛伏期進行t檢驗或方差分析。但趨于平穩(wěn)的后3 d的平均逃避潛伏期代表記憶水平，僅在生理狀態(tài)下的大鼠才表現(xiàn)如此。而實驗記憶損傷組大鼠后3 d的逃避潛伏期仍然持續(xù)下降。且在給予某種處理后，在不同的時間點上從同一受試對象上重復測量獲得的數(shù)據(jù)受多種因素影響，同一受試動物的不同時間點所測得的逃避潛伏期存在高度的自相關性，據(jù)此我們試驗中定位航行試驗的逃避潛伏期采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。然后分別對第1天最初潛伏期和第5天測試潛伏期進行單因素方差分析。

本實驗發(fā)現(xiàn)AD大鼠模型組大鼠的學習記憶能力明顯下降，而應用胰島素后，大鼠在定向航行試驗、空間探索試驗中學習記憶能力均明顯改善，表明胰島素具有改善AD大鼠學習記憶的作用。但胰島素組的潛伏期明顯縮短可能是實驗例數(shù)較少的緣故。雖已有證據(jù)表明腦組織可自身合成胰島素，然而這種合成功能僅局限于少數(shù)腦區(qū)，且合成量甚微。動物實驗證明，I125標記的胰島素能通過兔的血腦屏障，中央隆起和微血管中存在血漿胰島素的專一吸收位點。因此本實驗采用皮下注射胰島素的方法既避免了腦室內(nèi)給藥造成大腦機械性損傷的可能，也說明外周胰島素水平可以影響腦內(nèi)胰島素的含量，對擬AD大鼠模型有治療作用。在海馬HE、剛果紅染色方面，模型組表現(xiàn)顆粒細胞帶明顯受損，局部神經(jīng)元大量缺失，細胞排列疏松紊亂，部分細胞缺失，注射點附近出現(xiàn)彌漫性膠質(zhì)細胞反應，胰島素組顆粒細胞帶輕度受損，神經(jīng)元排列尚規(guī)則。胰島素皮下注射3 w的擬模型大鼠與模型組比較，CA1區(qū)Aβ1～40表達明顯減少或消失，提示胰島素具有改善擬 AD模型大鼠腦組織病理改變及降低Aβ1～40表達的作用，證實了胰島素的治療作用。該實驗治療時間較長共21 d，大鼠學習記憶能力改善明顯，但仍不能完全改變已形成的病理變化，如停止給藥病理變化可能會繼續(xù)進展，因此還應進行延長胰島素治療時間的實驗，以探討長期應用胰島素治療AD療效。

對AD患者的研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)IR增加，但信息傳導途徑障礙，即存在與2型糖尿病相似的信號轉(zhuǎn)導，認為胰島素能通過抑制人神經(jīng)細胞株糖原合成激酶－3的活性，抑制細胞外淀粉樣蛋白的沉積。據(jù)此推論，胰島素皮下注射擬AD模型大鼠使Aβ1～40表達減少可能是大鼠學習記憶能力改善的原因之一，但這一機制還需進一步探究。本實驗未對外周及腦內(nèi)Aβ1～40及胰島素水平進行檢測，并與臨床資料進行比對，該模型是否符合AD的病理生理進展過程還需要進一步驗證。

1 Vicioso BA.Dementia:when is it not Alzheimer disease〔J〕?Am J Med Sci，2002;324(2):84－95.

2 Song IU，Kim JS，Kim YI，et al.Clinical significance of silent cerebral infarctions in patients with Alzheimer disease〔J〕.Cogn Behav Neurol，2007;20(2):93－8.

3 Selkoe DJ.Clearing the brain′s amyloid cobwebs〔J〕.Neuron，2001;32(2):177－80.

4 Collin RP，Randy JS，Craft S，et al.Intracerbroventricular insulin enhances memory in a passive－avoidance task〔J〕.Physiol Behavior，2000;68:509－14.

5 Zhang G，F(xiàn)ei Z，Zhang X，et al.Therapeutic window of insulin treatment for cerebral ischemic reperfusion injury in rats〔J〕.J Fourth Mil Med Univ，2000;219:1083－5.

6 姜禮紅，張一娜，宋芳芳，等.凝聚態(tài)Aβ1～40海馬內(nèi)注射致AD大鼠在體神經(jīng)毒性作用〔J〕.南京醫(yī)科大學學報，2007;27(12):1373－6.

7 諸葛啟釧.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:27－38.

8 Kudo K，Wati H，Qiao C，et al.Age－related disturbance of memory and CREB phosphorylation in CA1 area of hippocampus of rats〔J〕.Brain Res，2005;1054(1):30－7.

9 Sanderson DJ，Pearce JM，Kyd RJ，et al.The importance of the rat hippocampus for learning the structure of visual arrays〔J〕.Eur J Neurosci，2006;24(6):1781－8.

10 Gasparini L，Gouras GK，Wang R，et al.Stimulation of beta－amyloid precursor protein trafficking by insulin reduces intraneuronal beta－amyloid and requires mitogen－activated protein kinase signaling〔J〕.J Neurosci，2001;8:2561－70.

11 Guidetti C，Paracchini S，Lucchini S，et al.Prevention of neuronal cell damage induced by oxidative stress in vitra effect of different Ginkgo biloba extracts〔J〕.J Pharmacol，2001;53(3):387－92.

12 Hoyer S.The brain insulin signal transduction system and sporadic(type II)Alzheimer disease:an update〔J〕.J Neural Transm，2002;109:341－60.

13 Hoyer S.Glucose metabolism and insulin receptor signal transduction in Alzheimer disease〔J〕.Eur J Pharmacol，2004;490(1－3):115－25.

14 Sharma M，Gupta YK.Intracerebroventricular injection of streptozotocin in rats produces both oxidative stress in the brain and cognitive impairment〔J〕.Life Sci，2001;68(9):1021－9.