劉 勇 張 寰 顧秀峰 李煥明 劉乃豐 (天津市第四中心醫(yī)院，天津 30040)

糖尿病患者易患動(dòng)脈粥樣硬化，持久的高血糖狀態(tài)最終形成具有高度活性的糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，而AGEs在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。同時(shí)，在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)扮演了重要的角色，其中MMP－2(明膠酶A)與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系越來(lái)越引起人們關(guān)注。在動(dòng)脈粥樣硬化及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄病灶中，MMP－2表達(dá)明顯增多，血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞都可表達(dá)并分泌 MMP－2〔1，2〕。AGEs可能通過(guò)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控MMP－2的表達(dá)和活性，從而影響糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。本研究從AGEs對(duì)MMP－2表達(dá)影響這一角度，探討其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304(上海細(xì)胞生物研究所)，牛血清白蛋白(BSA，Amresco公司)，D－葡萄糖(重慶北培化學(xué)試劑廠)，M199培養(yǎng)基(低糖，GIBCO公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Hepes(Amresco公司)，明膠(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 AGE－BSA的制備 在pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入BSA及D－葡萄糖(BSA終濃度為5.0 g/L，葡萄糖終濃度為50 mmol/L)，過(guò)濾除菌后37℃無(wú)菌孵育12 w。對(duì)照組BSA不含葡萄糖。

1.2.2 人血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以20%小牛血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，后以0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×106個(gè)/ml，接種于6孔板，2 ml/孔中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后分兩組，每組均設(shè)對(duì)照組(Control)及BSA組，兩組均不含葡萄糖。第1組加入葡萄糖濃度為50 mmol/L孵育的不同濃度的 AGE－BSA(50、100、200、400 mg/L)分別干預(yù)24 h。第2組加入葡萄糖濃度為50 mmol/L孵育的AGE－BSA(濃度為200 mg/L) 分別干預(yù) 0、12、24、36、48 h 和 72 h。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞總RNA的提取 取干預(yù)好的細(xì)胞，留取上清，直接于6孔培養(yǎng)板中提取內(nèi)皮細(xì)胞總RNA。用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入1 ml Trizol，然后分別以氯仿、異丙醇和無(wú)RNA酶75%乙醇提取內(nèi)皮細(xì)胞總RNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)光密度OD260/OD280均在1.7以上，說(shuō)明RNA純度較高。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) MMP－2引物依據(jù) McKenna等〔3〕報(bào)道的序列，β－肌動(dòng)蛋白(β－actin)(內(nèi)參照)引物依據(jù)Izumi等〔4〕報(bào)道的序列并與基因庫(kù)(GenBank)上下載的mRNA序列核對(duì)無(wú)誤，均由上海生工生物工程公司合成。MMP－2引物序列:上游5′－CAGGCTCTTCTCCTTTCACAAC－3′，下游5′－AAGCCACGGCTTGGTTTTCCTC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 398 bp。β－actin引物序列:上游 5′－GGTCAGAAGGATTCCTATGTG－3′，下游 5′－ATTGCCAATGGTGATGACCTG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 615 bp。以2 μg總 RNA為模板，加入 Oligo(DT)18、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、逆轉(zhuǎn)錄酶(M－MLV)5 × 緩沖液、dNTP、RNasin，總反應(yīng)體系25 μl，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件:cDNA、10 × 緩沖液、MgCl2、dNTP、MMP－2 引物、β－actin 引物、Taq DNA聚合酶，總反應(yīng)體系50 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃ 2 min，然后94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min 進(jìn)行30 次循環(huán)擴(kuò)增，72℃延伸8 min。取6 μl PCR產(chǎn)物與1 μl上樣緩沖液混合后上樣于1.7%瓊脂糖凝膠，同時(shí)以5 μl 100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)記點(diǎn)樣，以0.5×Tris鹽溶液(TBE)為緩沖液電泳，用Image Master VDS掃描分析儀掃描凝膠，以β－actin為內(nèi)參照，用Total Lab分析軟件對(duì)RT－PCR結(jié)果進(jìn)行吸光度分析，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，與GenBank查到的序列對(duì)照，核對(duì)無(wú)誤，進(jìn)一步證實(shí)了PCR產(chǎn)物的正確。

1.2.5 明膠酶圖檢測(cè) MMP－2活性 配制10%分層膠(含0.2%明膠，56℃助溶)、5%濃縮膠。取不同條件刺激的細(xì)胞培養(yǎng)液20 μl上樣，以恒壓 200 V，電泳 45～50 min。凝膠經(jīng)2.5%Triton X－100漂洗2次，每次10 min，于反應(yīng)緩沖液〔Tris－HCl 50 mmol/L(pH7.4～7.6);NaCl 50 mmol/L;CaCl210 mmol/L;1%Triton X－100〕中37℃孵育過(guò)夜，0.5%考馬斯亮藍(lán)R－250(0.5%考馬斯亮藍(lán)R－250;45%甲醇;10%乙酸)染色3 h，脫色液(40%甲醇;10%乙酸)脫色至藍(lán)色背景下白色條帶清晰可見。明膠酶圖結(jié)果用Gel－pro32 Analyzer軟件進(jìn)行光密度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Prism3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，采用 One－Way ANOVA，組間比較采用 Newman－Keuls方法。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR法分析AGEs調(diào)控MMP－2表達(dá)的濃度效應(yīng) 干預(yù)24 h后 Control組 ECV304細(xì)胞表達(dá)一定量的 MMP－2(0.225±0.024);與 Control組相比，BSA 組對(duì)MMP－2的 mRNA表達(dá)(0.241±0.041)無(wú)影響(P＞0.05);與BSA組比較，AGEBSA各濃度組 MMP－2的表達(dá)水平均明顯升高(50、100、200、400 mg/L組 MMP－2 mRNA 表達(dá)量分別為 0.570±0.020，0.689±0.027，0.882±0.058，0.863±0.031)，差異顯著(P ＜0.01)，其中AGE－BSA的濃度為200 mg/L調(diào)控 MMP－2的表達(dá)效應(yīng)最佳，見圖1。

2.2 RT－PCR法分析AGEs調(diào)控MMP－2表達(dá)的時(shí)間效應(yīng) 與Control組相比，BSA組對(duì)MMP－2的mRNA表達(dá)無(wú)影響，無(wú)明顯差異(P＞0.05);與BSA組相比較，AGE－BSA各時(shí)間組 MMP－2的表達(dá)均明顯升高(0、12、24、36、48、72 h MMP－2 mRNA 表達(dá)水平分別為0.180±0.025，0.304±0.036，0.677±0.029，0.622±0.018，0.582±0.027，0.561±0.016)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，其中在12 h時(shí)已經(jīng)升高，24 h時(shí)達(dá)到最高(P＜0.01)，以后仍維持較高水平。見圖2。

2.3 明膠法分析AGEs調(diào)控ECV304細(xì)胞MMP－2表達(dá)后對(duì)其活性的影響 對(duì)照組及不同濃度給藥組(干預(yù)24 h)的培養(yǎng)上清均可在72 kD的位置使明膠發(fā)生降解。與 Control組(3.131±0.367)相比，BSA組(3.632±0.730)誘導(dǎo) ECV304細(xì)胞MMP－2表達(dá)后對(duì)其活性無(wú)明顯影響，降解明膠無(wú)明顯差異(P＞0.05);與BSA組相比較，AGE－BSA不同濃度給藥組誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞 MMP－2表達(dá)后均能升高其活性(50、100、200 mg/L組 MMP－2 mRNA表達(dá)量分別為 6.853±1.017，9.012±1.518，11.968±1.341)，降解明膠逐漸增強(qiáng)(P ＜0.01)。見圖3。

圖1 不同濃度的AGE-BSA干預(yù)ECV304細(xì)胞24 h時(shí)MMP-2 mRNA的表達(dá)

圖2 相同濃度的AGE-BSA干預(yù)ECV304細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)MMP-2 mRNA表達(dá)

圖3 AGEs調(diào)控ECV304細(xì)胞MMP-2表達(dá)后對(duì)其活性的影響

3 討論

糖尿病血管并發(fā)癥是最常見的也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。持久的高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等糖基化，經(jīng)過(guò)一系列非酶促反應(yīng)，最終形成具有高度活性的AGEs。目前的研究表明動(dòng)脈粥樣硬化病灶中可檢測(cè)出AGE，在糖尿病及冠心病人血清中AGE濃度亦明顯升高〔5〕，而且AGE能夠增強(qiáng)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞趨化蛋白1基因和MMP－2的表達(dá)，抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)氧化體增殖物激活型受體γ基因的表達(dá)〔6〕。本研究前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明糖尿病小鼠血清AGE水平顯著增高，而且隨糖尿病病程的遷延，其增高的水平越來(lái)越明顯〔7〕。提示AGE可能通過(guò)誘導(dǎo)MMP－2的表達(dá)參與糖尿病后血管病變。

本研究表明細(xì)胞外基質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶主要是MMPs，而MMPs是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，可分為四大類，即膠原酶、明膠酶、基質(zhì)水解酶和膜型－MMPs(MT－MMPs)。其中MMP－2在血管壁中的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)。在糖尿病患者、急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者以及患有糖尿病的急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者中 MMP－2 水平升高〔8〕。Hoffmann 等〔9〕的研究表明，AGE刺激培養(yǎng)的脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞MMP－2的表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AGE－BSA能夠誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP－2表達(dá)，并增強(qiáng)其降解明膠活性，且這種效應(yīng)具有時(shí)間和濃度依賴性。糖基化與氧化應(yīng)激密切相連，蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖化時(shí)也有氧自由基的產(chǎn)生，糖化脂蛋白容易發(fā)生過(guò)氧化，AGEs即氧化糖基化的不可逆產(chǎn)物。氧化應(yīng)激在糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而MMP－2對(duì)氧化應(yīng)激很敏感。最近Kowluru等〔10〕在研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展中發(fā)現(xiàn)，高糖可以促進(jìn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞MMP－2表達(dá)增加、活性增強(qiáng)，而抗氧化應(yīng)激可以抑制MMP－2的表達(dá)。因此，推測(cè)AGEs可能通過(guò)降低超氧化物歧化酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加，MMP－2表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，參與了糖尿病后血管動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。深入研究AGEs與MMP－2之間的相互作用，將為深入了解糖尿病易患動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制及其合理防治提供新思路。

1 Faia KL，Davis WP，Marone AJ，et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in hamster aortic atherosclerosis:correlation with in－situ zymography〔J〕.Atherosclerosis，2002;160(2):325－37.

2 Hojo Y，Ikeda U，Katsuki T，et al.Matrix metalloproteinase expression in the coronary circulation induced by coronary angioplasty〔J〕.Atherosclerosis，2002;161(1):185－92.

3 McKenna GJ，Chen Y，Smith RM，et al.Arole for matrix metalloproteinases and tumor host interaction in hepatocellular carcinomas〔J〕.Am J Surg，2002;183(5):588－94.

4 Izumi S，Hirai K，Miyamasu M，et al.Expression and regulation of monocyte chemoattractant protein－1 by human eosinophils〔J〕.Eur J Immunol，1997;27(4):816－24.

5 劉乃豐，孫子林，童嘉毅，等.冠心病患者血清糖基化終產(chǎn)物水平升高的意義〔J〕. 中華心血管病雜志，2001;29(2):94－6.

6 顧秀峰，劉 勇，劉乃豐.糖基化終產(chǎn)物對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MMP－2 表達(dá)的影響〔J〕. 天津醫(yī)藥，2006;34(12):871－4.

7 孫子林，劉乃豐，孫桂菊，等.糖尿病小鼠血清糖基化終產(chǎn)物水平增高〔J〕. 中國(guó)糖尿病雜志，2000;8(5):315，320.

8 Derosa G，D′Angelo A，Scalise F，et al.Comparison between metalloproteinases－2 and －9 in healthy subjects，diabetics，and subjects with acute coronary syndrome〔J〕.Heart Vessels，2007;22(6):361－70.

9 Hoffmann S，F(xiàn)riedrichs U，Eichler W，et al.Advanced glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation，matrix metalloproteinase－2 and VEGF upregulation in vitro〔J〕.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2002;240(12):996－1002.

10 Kowluru RA，Kanwar M.Oxidative stress and the development of diabetic retinopathy:contributory role of matrix metalloproteinase－2〔J〕.Free Radic Biol Med，2009;46(12):1677－85.