黎志財 周 靜 張 倩 朱冬梅 黃 敏 吳遠帆 韓 藝 周蘇明

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科ICU，江蘇 南京 210029)

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房患者特別是老年患者主要的死亡原因之一，發(fā)病率和病死率較高。當(dāng)細菌、病毒等病原微生物感染侵入血液循環(huán)時，其成分如細菌脂多糖(LPS)、細菌脂蛋白(BLP)、病毒DNA均可激活免疫系統(tǒng)，瀑布式地導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，破壞機體免疫平衡，損害機體組織器官功能。約50%的膿毒癥患者伴有心功能障礙，病死率可上升到70%〔1〕。因此，防治膿毒癥所致的心功能障礙具有重要的臨床意義。白介素-10(IL-10)是一種多能免疫調(diào)節(jié)細胞因子，在多種心臟疾病中具有保護心功能的作用，但IL-10在膿毒癥時對心功能的影響目前尚不是十分清楚。本文通過體外實驗探討IL-10對BLP誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 1～3日齡新生SD乳鼠，雌雄不限，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 BLP(美國Alexis公司);重組大鼠IL-10(美國Peprotech公司);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司);膠原酶Ⅱ型、5-溴-2脫氧尿嘧啶(5-Brdu)(美國Sigma公司);半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)、bcl-2和bax蛋白一抗(美國 CST 公司)，β-肌動蛋白(β-actin)和 α-微管蛋白(α-tubulin)一抗、二抗(博士德公司)，辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG(美國KPL公司);其他試劑均為分析純;CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司);恒溫搖床(上海新苗公司);小型垂直電泳槽、電泳電源及轉(zhuǎn)移裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 參考文獻報道〔2〕，并加以改進。取1～3日齡新生SD乳鼠10只，在超凈工作臺中迅速開胸取出心臟放入預(yù)冷的D-Hanks鹽平衡溶液中洗凈殘血，剔除心底部和心外膜的結(jié)締組織，將心室肌剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊。移入50 ml離心管中，加入0.06%的胰蛋白酶10 ml，37℃恒溫搖床中消化10 min，棄去上層懸液(主要為血細胞和細胞碎片)。隨后往下層組織塊中繼續(xù)加入0.08%的Ⅱ型膠原酶10 ml消化30 min，重復(fù)此步驟共消化2～3次，直至組織塊消失為止。每次消化后的上層懸液移入4 ml胎牛血清中中和酶液。最后200目篩網(wǎng)過濾全部上層懸液，1 000 r/min、10 min離心，重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1.5 h，收集未貼壁的細胞用臺盼藍染色鑒定細胞活力，以一定的密度接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，換液后繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d，使心肌細胞狀態(tài)達到最佳。

1.2.2 實驗分組和處理 第一部分實驗以1 μg/ml的BLP分別刺激乳鼠心肌細胞12、24、36、48 h，檢測caspase-3的表達，觀察BLP誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的時間效應(yīng)。第二部分實驗將細胞分為五組，空白對照組:未予任何刺激;BLP組:以1 μg/ml的BLP刺激心肌細胞24 h;IL-10組:以20 ng/ml的IL-10刺激細胞24 h;IL-10+BLP組:在BLP(1 μg/ml)刺激細胞4 h之前加入 IL-10(20 ng/ml)，共處理 24 h;BLP+IL-10組:BLP(1 μg/ml)刺激細胞4 h后加入IL-10(20 ng/ml)，共處理24 h，檢測caspase-3、bax及bcl-2的表達，觀察IL-10對BLP誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響。

1.2.3 Western印跡檢測心肌細胞caspase-3、bax及bcl-2蛋白表達 心肌細胞接種于六孔板中，給藥處理24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞3遍，加入80 μl細胞裂解液，于冰上裂解0.5 h，用細胞刮收取細胞于1.5 ml離心管中，4℃、12 000 r/min，離心 20 min，小心吸取上層懸液，即為細胞蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，調(diào)整各樣本蛋白濃度為同一濃度，加入上樣緩沖液，點樣，Tris-十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝胺垂直電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜50 min，5%的脫脂牛奶封閉2 h，洗膜，然后分別以稀釋后(1∶1 000)的一抗(caspase-3、bax和bcl-2抗體)4℃孵育過夜，再和二抗(抗兔IgG，1∶5 000稀釋)4℃反應(yīng)2 h，洗膜后于暗室內(nèi)加入發(fā)光液反應(yīng)1 min，曝光，顯影，定影。條帶掃描后，采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)，分別得到目的蛋白的灰度值，以α-tubulin作為內(nèi)參，計算相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析;兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細胞的培養(yǎng) 剛分離下來的心肌細胞呈球形，差速貼壁2 h后，收集未貼壁的心肌細胞接種于培養(yǎng)板中，24 h后大部分活細胞已貼壁，呈長梭形，偶見單個搏動的細胞;48 h后細胞貼壁完成，并逐漸擴展，呈多角形或不規(guī)則的星形，細胞較飽滿。第3天開始細胞伸出偽足，并相互交接成網(wǎng)，心肌細胞逐步形成單層和放射狀排列的細胞簇，每個細胞簇內(nèi)心肌細胞的搏動實現(xiàn)同步化，搏動頻率為60～80次/min。取第3～4天的細胞用于實驗。

2.2 BLP誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的時間效應(yīng) 心肌細胞經(jīng)BLP作用24 h即可觀察到有活性的切割片段(cleaved caspase-3)表達水平明顯升高，在36、48 h時表達量進一步上升;相反，其前體(procaspase-3)表達水平逐漸下降。選取24 h為下面實驗的觀測時間點。見圖1。

圖1 BLP對心肌細胞caspase-3表達的時間效應(yīng)

2.3 IL-10對BLP誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響 見圖2。與正常對照組相比，在BLP組中BLP使心肌細胞cleaved caspase-3及bax的蛋白表達明顯增加(P＜0.01)，而bcl-2/bax的比率明顯降低(P＜0.01);與BLP組比較，IL-10+BLP組和BLP+IL-10組均能明顯降低cleaved caspase-3及bax的表達(P＜0.01)，并且提高bcl-2/bax的比率(P＜0.01)。提示IL-10能夠拮抗BLP誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

圖2 IL-10對BLP誘導(dǎo)的心肌細胞caspase-3、bax及bcl-2表達的影響

3 討論

細胞凋亡維持著細胞存活與死亡的動態(tài)平衡，病理性的因素導(dǎo)致凋亡的不足或過盛均可引起疾病的發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠心功能明顯受到抑制的同時可觀察到心臟p53表達顯著升高，以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)介導(dǎo)的凋亡亦明顯增加〔3〕。心肌細胞屬于終末分化期細胞，心肌細胞的過度凋亡在感染引起的心功能抑制中可能起到重要作用。膿毒癥時過度的炎癥因子如TNF-α產(chǎn)生是引起心肌凋亡的重要原因之一，而bax、bcl-2以及caspase-3在TNF-α誘導(dǎo)凋亡的機制中起到重要角色。bcl-2和bax在凋亡的細胞內(nèi)途徑中起到門控的作用，bcl-2可以抑制線粒體釋放促凋亡蛋白，抑制凋亡蛋白酶的激活，而bax的作用與bcl-2相反，bcl-2和bax的比率是決定細胞命運的一個關(guān)鍵因素。caspase-3是凋亡至關(guān)重要的執(zhí)行者，它負責(zé)對一些細胞存活所需的關(guān)鍵蛋白進行降解，如DNA修復(fù)酶。caspase-3的作用發(fā)揮需要其 procaspase-3裂解為cleaved caspase-3。然而，本實驗發(fā)現(xiàn)BLP能夠顯著激活心肌細胞caspase-3，促進bax表達增加，從而使bcl-2/bax的比率降低，直接促進心肌細胞的凋亡。BLP是廣泛存在于細菌細胞膜上的一種成分，能夠誘導(dǎo)人單核細胞(THP-1)快速的釋放TNF-α〔4〕，BLP促進心肌細胞的凋亡效應(yīng)是否為其產(chǎn)生 TNF-α的能力所致，需我們進一步探討。

IL-10是一種具有多效性的細胞因子，能夠抑制多種炎癥因子，如TNF-α和IL-1β的表達，并能夠增加一些抗炎因子的表達，如IL-1受體拮抗劑和可溶性TNF-α受體。IL-10基因敲除小鼠表現(xiàn)出對內(nèi)毒素血癥過度的炎癥反應(yīng)〔5〕;Kaur等〔6〕發(fā)現(xiàn)實驗大鼠在心肌梗死后第4、8、16周，IL-10的表達水平明顯降低，這種下降趨勢和心功能的惡化有著并行的關(guān)系;此外在病毒性心肌炎所致心力衰竭的模型中，應(yīng)用外源性的IL-10治療可明顯降低小鼠的死亡率〔7〕;在最近的一項研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死的實驗動物中，靜脈注射IL-10后，心肌炎癥因子和巨噬細胞浸潤明顯減少，并且可明顯改善大鼠的左室功能〔8〕。以上研究表明，IL-10和心功能的改善有著密切的聯(lián)系。然而，IL-10對膿毒癥時心功能抑制的影響，目前鮮有相關(guān)文獻報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用低劑量的BLP使膿毒癥小鼠免疫耐受后，可明顯改善小鼠的心功能，并同時觀察到心肌IL-10表達水平較未耐受小鼠增高，提示IL-10可能參與耐受后小鼠心功能的改善。本實驗顯示:與BLP組比較，不管是IL-10預(yù)處理組或是后處理組，IL-10均能夠明顯減弱BLP誘導(dǎo)的心肌細胞caspase-3的激活以及上調(diào)bcl-2/bax的比率，拮抗BLP誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，此種抗凋亡效應(yīng)可能是IL-10改善感染后心肌抑制的機制之一。

本實驗結(jié)果表明，BLP能夠直接誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞凋亡，而IL-10能夠拮抗BLP的促凋亡效應(yīng)。IL-10發(fā)揮作用是通過抑制caspase-3蛋白的表達、上調(diào)bcl-2/bax比率來抑制心肌細胞的凋亡，對心肌細胞起到保護作用。本文為臨床防治感染所致的心功能抑制提供了新的理論及實驗依據(jù)。

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