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        大黃素對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞放射增敏作用與細(xì)胞自噬關(guān)系的研究

        2012-07-28 09:57:48陳冬蓮侯華新黎丹戎
        中國(guó)藥理學(xué)通報(bào) 2012年11期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞器溶酶體黃素

        陳冬蓮,侯華新,鄭 華,梁 燕,黎丹戎

        (廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣西南寧 530021)

        越來(lái)越多的研究表明自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,且腫瘤的放化療過(guò)程可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡,如Peng等[1]在研究小檗堿對(duì)A549放射增敏作用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)放射增敏與細(xì)胞自噬能力之間有著緊密的聯(lián)系。本課題前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)廣西產(chǎn)何首烏中無(wú)細(xì)胞毒作用濃度5 mg·L-1大黃素聯(lián)合2Gy射線照射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1具有明顯的放射增敏作用,放射增敏比為 1.39[2],為了研究大黃素在放射增敏過(guò)程中是否伴隨著自噬的發(fā)生及其作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電鏡觀察大黃素在放射增敏過(guò)程鼻咽癌細(xì)胞CNE-1自噬體形成的超微結(jié)構(gòu)變化,real-time PCR定量檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá),探討放射增敏與自噬發(fā)生的關(guān)系。

        1 材料

        1.1 細(xì)胞來(lái)源 人鼻咽癌高分化CNE-1細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

        1.2 主要試劑 大黃素由課題組前期從廣西何首烏分離獲得并經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定,純度為99%。實(shí)驗(yàn)中加入無(wú)細(xì)胞毒作用濃度5 mg·L-1。TRIzol REAGENT(Invitrogen公司,美國(guó))、異丙醇和三氯甲烷為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?、DEPC處理水、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司,美國(guó))、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司出品)、滅菌注射用水、RPMI 1640(Gibco公司)

        1.3 主要儀器 超低溫高速離心機(jī)5810 R(德國(guó)Eppendorf公司)、ABI 7300 Real-time PCR 儀、Nano Drop 2000(Thermo公司)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、倒置相差熒光顯微鏡Axiovert 200。采用60Co射線(加拿大Theratronics產(chǎn)品)為照射源,劑量率94.41 cGy·min-1,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行相應(yīng)劑量的照射。

        1.4 引物序列 根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人ULK1、GABARAPL1、Beclin1、Bcl-2 核酸序列,設(shè)計(jì)特異PCR引物,以β-actin作為內(nèi)參照,引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成,其引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)Tab 1。

        Tab 1 Primer sequences and product lengths

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于37℃ 體積百分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),以含體積百分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)單層傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分成4組,空白對(duì)照(A組):用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。大黃素(B組):給予無(wú)細(xì)胞毒終濃度為5 mg·L-1的大黃素,藥物作用24 h,繼續(xù)培養(yǎng)16 h。照射(C組):給予60Co2Gy照射后,繼續(xù)培養(yǎng)16 h。放射增敏(D組):終濃度為5 mg·L-1大黃素作用細(xì)胞24 h后給予60Co2Gy照射,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

        2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 各組細(xì)胞經(jīng)上述處理后,用PBS漂洗細(xì)胞表面3次,胰酶消化后將細(xì)胞離心成團(tuán),加入預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%戊二醛,4℃過(guò)夜,送檢。

        2.4 Real-time PCR法檢測(cè)ULK1、GABARAPL1、Beclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)上述處理后,提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)Nano Drop 2 000定量測(cè)定濃度,1.9≤A260/A280≤2.1,10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。取2 μg總 RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)條件見(jiàn)Tab 2。

        Tab 2 PCR amplification reaction conditions of target gene

        參照文獻(xiàn)[3]的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)以下公式求出目的基因相對(duì)表達(dá)指數(shù) F=10△CT,T/AT△CT,R/AR

        該公式中,△CT,T表示實(shí)驗(yàn)組減去空白對(duì)照組目的基因Ct值的差,△CT,R表示實(shí)驗(yàn)組減去空白對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值的差,AT表示目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,AR表示內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,F(xiàn)表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于空白對(duì)照組的表達(dá)量,將其作為定量結(jié)果并用于分析。

        3 結(jié)果

        3.1 鼻咽癌各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 在透射電鏡下,與空白對(duì)照組比較,各實(shí)驗(yàn)組均觀察到細(xì)胞胞質(zhì)中空泡增多,線粒體腫脹變性,在這些變性的細(xì)胞器周?chē)霈F(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu),有的被雙層膜環(huán)繞,形成典型的自噬體和自噬溶酶體的自噬現(xiàn)象,以大黃素組和放射增敏組尤為明顯,結(jié)果見(jiàn)Fig 1。

        Fig 1 Autophagosomes found under TEM(n=3)

        3.2 鼻咽癌各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)情況ULK1、Beclin1、GABARAPL1、Bcl-2 基因的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線基本擬合良好,各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)0.99以上和擴(kuò)增效率90% 以上,說(shuō)明 PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定,結(jié)果可靠。各實(shí)驗(yàn)組基因mRNA表達(dá)情況結(jié)果見(jiàn)Fig 2。

        Fig 2 ULK1,GABARAPL1,Beclin1,Bcl-2 mRNA expression in different groups of CNE-1 cells(n=3)

        與空白組比較,各組ULK1mRNA表達(dá)均升高(P<0.05),其中大黃素增敏組表達(dá)最高(P<0.01);而B(niǎo)eclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào),但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GABARAPL1除大黃素增敏組明顯升高外(P<0.05),其它各組變化不明顯(P>0.05)。

        4 討論

        細(xì)胞自噬是生物有機(jī)體適應(yīng)不同環(huán)境的有效的內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制,它的發(fā)生發(fā)展主要分為4個(gè)階段[4]:①細(xì)胞受到誘導(dǎo),在胞質(zhì)內(nèi)形成小而扁平的由雙層膜構(gòu)成的自噬泡;②自噬泡延伸,包裹受損的細(xì)胞器和變性蛋白及核酸等,形成密閉的球狀自噬體;③自噬體可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡等;④形成自噬溶酶體。自噬過(guò)程中出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)及其形態(tài),可以通過(guò)透射電鏡觀察到。本研究的電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)除空白對(duì)照組外,其余各組均出現(xiàn)了自噬泡或自噬體,特別是大黃素放射增敏組出現(xiàn)大量的自噬體及自噬溶酶體??梢酝茰y(cè),大黃素放射增敏作用可能與大黃素屬于生物還原性物質(zhì),易于穿透細(xì)胞膜,聚集于胞質(zhì)內(nèi),產(chǎn)生活性氧,引起細(xì)胞線粒體等細(xì)胞器的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度自噬有關(guān)。

        細(xì)胞自噬往往是一把雙刃劍,它可使細(xì)胞器自我更新,維持細(xì)胞自身代謝從而抵抗外部環(huán)境的影響,而自噬的過(guò)度激活又可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器受損,發(fā)生自噬性死亡。自噬的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多條途徑的復(fù)雜的程序化過(guò)程,一系列自噬相關(guān)基因有序的參與其中。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,當(dāng)上游自噬信號(hào)被激活后,ULK1發(fā)生去磷酸化,與多種自噬相關(guān)基因形成啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵復(fù)合物,促進(jìn)下游自噬信號(hào)激活[5-6]。GABARAPL1 主要結(jié)合于自噬體或溶酶體膜上,該基因的上調(diào)可使形成的獨(dú)特膜性結(jié)構(gòu)(phagophore)不斷延伸,直至完全包裹待降解的細(xì)胞質(zhì)組分 ,由此形成自噬體。當(dāng)自噬體和溶酶體融合后,GABARAPL1表達(dá)量下降[7]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照細(xì)胞比較,低劑量射線、無(wú)細(xì)胞毒劑量大黃素與細(xì)胞作用后,細(xì)胞通過(guò)自噬,產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng),促使細(xì)胞對(duì)抗環(huán)境的變化,保持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)而免受損傷。而放射增敏組的ULK1急劇升高,GABARAPL1 mRNA呈現(xiàn)過(guò)表達(dá),可能此時(shí)過(guò)多的細(xì)胞器或者蛋白質(zhì)進(jìn)入自噬小泡而被降解,細(xì)胞的功能?chē)?yán)重受損,出現(xiàn)不可逆的改變,從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入自噬性死亡階段。

        有文獻(xiàn)研究表明,自噬與凋亡在某些情況下受控于同一刺激物并產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng),兩者的相互作用取決于受試物和細(xì)胞所處的環(huán)境[8]。Beclin1基因是細(xì)胞自噬過(guò)程中重要的正調(diào)節(jié)因子。它主要通過(guò)與PI3K3C形成復(fù)合體來(lái)調(diào)節(jié)其它的自噬相關(guān)蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位[9]。已有文獻(xiàn)證實(shí)通過(guò)上調(diào)Beclin1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生。Bcl-2是調(diào)節(jié)凋亡的重要蛋白之一,定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和連續(xù)的核膜上,Bcl-2 mRNA表達(dá)下降自噬增加。此外Beclinl可以通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2的相互作用并抑制自噬體形成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時(shí),Beclin1與Bcl-2相互結(jié)合,抑制細(xì)胞自噬,當(dāng)內(nèi)環(huán)境被打破后,二者分離,Beclin1依賴的自噬增加[10],可見(jiàn) Beclin1與 Bcl-2表達(dá)與自噬和凋亡活性密切相關(guān)。本研究顯示,在不同的條件下,各組細(xì)胞Beclin1、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況出現(xiàn)下降。這可能是由于細(xì)胞受到藥物或射線等刺激后,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境被破壞,Beclin1與Bcl-2結(jié)合程度不同,部分細(xì)胞進(jìn)入了凋亡程序性死亡通道。究竟大黃素在放射增敏過(guò)程中如何實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬性死亡和凋亡程序性死亡的調(diào)控,有待進(jìn)一步深入研究。

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