張建新，丁艷艷，李蘭芳，劉 芳，張勤增，解麗君，郝 娜

(河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河北 石家莊 050021)

研究顯示，急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象存在［1］。細(xì)胞凋亡是按細(xì)胞的固有基因程序進(jìn)行的一種生理現(xiàn)象，不同于一般病理情況下的細(xì)胞死亡，是機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過(guò)基因調(diào)控和酶促反應(yīng)進(jìn)行的細(xì)胞程序化死亡。近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，本研究室前期實(shí)驗(yàn)表明，大鼠在急性心肌缺血過(guò)程中內(nèi)源性H2S的含量明顯下降，心肌組織CSE活性明顯降低，線粒體功能受損，給予H2S可明顯減輕心肌缺血損傷，改善心功能和線粒體功能，從而有效保護(hù)缺血的心肌［2－3］。但是其對(duì)缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了H2S供體—硫氫化鈉(NaHS)對(duì)大鼠急性心肌缺血后心肌細(xì)胞凋亡率、caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討H2S對(duì)缺血受損心肌的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 NaHS、溴化乙啶(ethidium bromide，EB)，美國(guó)Sigma公司?？捡R斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。兔抗活化型caspase-3單抗，武漢博士德。鼠抗Bcl-2單抗、鼠抗Bax單抗、丙烯酰胺、N，N-亞甲雙丙烯酰胺，美國(guó)Santa Cruz公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 儀器 電動(dòng)勻漿器(Silentcrusher M，德國(guó)Heidolph公司)。電泳儀(DYY-Ⅲ7B型)。水浴式電轉(zhuǎn)膜儀(DYY-Ⅲ40B型)。顯微鏡(Olympus BX40型)。低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。流式細(xì)胞儀(Epics-XLⅡ型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量(270±20)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 模型制備及動(dòng)物分組

1.4.1 大鼠急性心肌缺血模型制備 將大鼠用10%水合氯醛350 mg·kg－1腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，剪去胸前手術(shù)區(qū)毛，碘酒消毒，用血管鉗沿第4肋間鈍性分離肋間肌約3 cm長(zhǎng)，打開(kāi)胸腔，撐開(kāi)4、5肋骨剪開(kāi)心包膜將心臟輕輕擠出，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間平左心耳下緣迅速結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近段，立即關(guān)閉胸腔擠出胸腔內(nèi)的氣體，以恢復(fù)負(fù)壓，幫助大鼠恢復(fù)自主呼吸。將肌肉層和皮膚分別縫合，制備急性心肌缺血模型。

1.4.2 動(dòng)物分組與給藥 健康成年♂ SD大鼠40只隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為:① 假手術(shù)組;②缺血組;③ 缺血 +NaHS低劑量組;④ 缺血 +NaHS中劑量組;⑤缺血+NaHS高劑量組。缺血組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支3 h時(shí)腹腔注射2 ml·kg－1生理鹽水，缺血+NaHS低、中、高劑量組分別于結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支3 h時(shí)腹腔注射0.78、1.56和3.12 mg·kg－1的NaHS(用時(shí)現(xiàn)用生理鹽水配置，均為2 ml·kg－1)，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，各組大鼠均于結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支6h時(shí)處死，取心臟備用。取心尖部分心肌置于10%甲醛溶液中固定用于免疫組化法檢測(cè);置于 －80℃冰箱保存，進(jìn)行Western blot分析;置于70%的乙醇溶液中固定用于FCM測(cè)定。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.5.1 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取心尖部，剪碎，70%冷乙醇固定。棄去固定組織的70%酒精，生理鹽水沖洗心肌組織塊，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨，邊研磨邊用PBS沖洗于容器中，用200目銅網(wǎng)過(guò)濾并收集懸液，1 000 r·min－1，離心 10 min，棄上清，用 PBS 制成單細(xì)胞懸液。應(yīng)用美國(guó)Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源300 mW氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，檢測(cè)前調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。每個(gè)樣本檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，以DNA組方圖出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞的多少，用Expo32 ADC軟件分析處理免疫熒光數(shù)據(jù)，計(jì)算凋亡百分率。

1.5.2 Western blot檢測(cè) caspase-3蛋白表達(dá) 將裂解的心肌組織離心，上清液與點(diǎn)樣緩沖液熱變性，做聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用吐溫-PBS洗滌，5%脫脂奶粉封閉，加稀釋的caspase-3一抗，再加相應(yīng)的二抗，DAB顯色后立即用水沖洗，照相，經(jīng)掃描后用美國(guó)UVP公司Lab Works 4.5軟件處理，確定相對(duì)吸光度值(每次對(duì)照的吸光度值為相對(duì)值1)。

1.5.3 免疫組化法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)采用ABC法，DAB顯色。Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，分別計(jì)數(shù)陽(yáng)性表達(dá)心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)并進(jìn)行匯總，計(jì)算蛋白表達(dá)陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分率。

1.6 HE染色觀察心肌組織學(xué)變化 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取心臟，冰生理鹽水沖凈血液，取左心室前壁部分組織，4%多聚甲醛固定，用70% ～100%的酒精梯度脫水，二甲苯中透明兩次，入石蠟內(nèi)進(jìn)行包埋，將修好的石蠟塊固定于石蠟切片機(jī)上切片，厚度為4 μm，將完全展開(kāi)的石蠟片貼附于清潔載玻片上，4℃ 保存?zhèn)溆?，常?guī)HE染色。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血后細(xì)胞凋亡率的變化 心肌缺血6 h后缺血組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);NaHS 3個(gè)劑量組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率明顯低于相應(yīng)的缺血組(P＜0.05或P＜0.01，Tab 1，F(xiàn)ig 1)。

2.2 心肌缺血后細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值的變化 免疫組化結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒，主要在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)少量的Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，缺血組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)少量的Bcl-2和大量Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P＜0.01)。與缺血組比較，缺血3 h時(shí)給予NaHS低、中、高劑量治療大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P ＜0.01，Tab 1，F(xiàn)ig 2，3)。

Tab 1 Effects of NaHS on the apoptosis rate and the expression of caspase-3，bcl-2 and Bax，and bcl-2/Bax in myocardium after ischemia in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of NaHS on the apoptosis rate and the expression of caspase-3，bcl-2 and Bax，and bcl-2/Bax in myocardium after ischemia in rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia group

Group Apoptotic/% caspase-3(RD)Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Sham 12.11 ±2.31 1.00 ±0.00 12.80 ±1.62 15.69 ±1.73 0.82 ±0.05 Ischemia 21.37 ±2.13＊＊ 3.94 ±0.39＊＊ 9.43 ±1.47 29.11 ±2.28＊＊ 0.32 ±0.02＊＊ischemia+NaHS(L)18.37 ±1.64# 3.2 ±0.35# 17.65 ±1.96# 21.08 ±1.47## 0.84 ±0.04##ischemia+NaHS(M)15.12 ±1.25# 2.68 ±0.33# 18.87 ±1.13## 19.27 ±1.23## 0.98 ±0.06##ischemia+NaHS(H)13.14 ±1.33## 2.50 ±0.25## 21.24 ±2.02## 17.67 ±1.59## 1.20 ±0.52##

Fig 1 Change of the apoptosis rate(%)in myocardium after ischemia in rats

2.3 心肌組織的形態(tài)學(xué)變化 HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻。缺血組大鼠部分區(qū)域心肌纖維橫紋不齊或消失，核偏移甚至裂解消失，有炎性因子滲出。NaHS低、中、高劑量治療組大鼠心肌缺血損傷程度明顯減輕(Fig 4)。

2.4 心肌缺血后caspase-3蛋白表達(dá)的變化Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞僅有少量的caspase-3的表達(dá);缺血后各組caspase-3表達(dá)量均明顯增加，缺血3 h治療3 h時(shí)，NaHS低、中、高劑量組與缺血組比較，心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)明顯降低 (P ＜0.05，Tab 1，F(xiàn)ig 5)。

3 討論

細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞主動(dòng)死亡形式具有復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，受許多因素的影響，細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要受細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，細(xì)胞凋亡的發(fā)生是促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間平衡喪失的結(jié)果，Bcl-2家族在各類刺激信號(hào)引起的凋亡中起關(guān)鍵作用［4］，其中Bcl-2和Bax是與凋亡密切相關(guān)的基因，Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細(xì)胞色素C等凋亡因子的釋放，抑制細(xì)胞凋亡，而Bax則介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2過(guò)量時(shí)，形成Bcl-2同源二聚體，細(xì)胞受到保護(hù)。當(dāng)Bax過(guò)量時(shí)，形成Bax同源二聚體，細(xì)胞則趨向凋亡，Bcl-2的抗凋亡作用是通過(guò)與Bax組成異源二聚體，從而阻止Bax介導(dǎo)凋亡的作用，因此，在凋亡刺激因子(如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、核酸內(nèi)切酶G)等作用下，這兩種蛋白的比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活［5］。caspase家族是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，其中caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)下游一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶［6］。正常情況下，胞質(zhì)中caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在，激活后可引起細(xì)胞凋亡，研究表明，心肌缺血/再灌注損傷的心肌中存在大量的凋亡細(xì)胞，認(rèn)為心肌缺血可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)和促進(jìn)死亡受體及配體的表達(dá)激活caspase-3，引起心肌細(xì)胞凋亡［7－9］。Bcl-2可通過(guò)干擾細(xì)胞色素C的釋放而阻斷上游caspase-3蛋白酶的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Bax蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分，使細(xì)胞色素 C得以穿過(guò)線粒體膜，激活caspase-9，進(jìn)一步激活 caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10－11］。

Fig 2 Change of the expression of Bax in myocardium after ischemia in rats

Fig 3 Change of the expression of Bcl-2 in myocardium after ischemia in rats

Fig 4 Pathological changes of myocardium by optical microscope after ischemia in rats(×400)

Fig 5 Change of the expression of Caspase-3 in myocardial tissue in rats

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性心肌缺血后，心肌損傷明顯，caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)則明顯升高，Bcl-2/Bax比值降低。假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)較弱的caspase-3表達(dá)，可能是手術(shù)刺激所致。缺血后3 h經(jīng) H2S供體NaHS治療，心肌缺血損傷明顯減輕，心肌細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值明顯升高。因此，在心肌缺血后，H2S減輕心肌缺血損傷、抑制急性心肌缺血損傷引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、caspase-3蛋白表達(dá)，升高Bcl-2/Bax比值有關(guān)，但是對(duì)其他細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白是否也有影響以及相關(guān)的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。

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