賀 敏，王靜鳳，柳 東，李 冰，王玉明，薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003)

海參營養(yǎng)和功效成分豐富，對人體具有很好的保健功能。海參體壁中富含海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白、海參腦苷脂等多種活性物質，具有較高的食用和藥用價值［1－2］。海參皂苷是海參的主要次生代謝產(chǎn)物，一般為羊毛甾烷型三萜皂苷，具有抗腫瘤、抗真菌、免疫調節(jié)、細胞毒作用和溶血作用等多種生理活性［3－4］。海參皂苷的結構因其種類和生長環(huán)境的不同而不同。革皮氏海參體壁中富含海參皂苷(含量為3.514%)，可作為海參皂苷的良好來源。王靜鳳等［5］研究發(fā)現(xiàn)，革皮氏海參總皂苷對小鼠具有明顯的免疫調節(jié)作用。劉治東［6］研究發(fā)現(xiàn)，革皮氏海參總皂苷能明顯抑制小鼠移植瘤的生長，并能明顯提高小鼠體內抗氧化和代謝致癌物質的能力。李冰等［2］從造血干細胞增殖和分化方面進行研究，發(fā)現(xiàn)革皮氏海參皂苷對骨髓損傷模型小鼠有促進造血的作用，但其作未用機制尚不明確。本實驗從細胞水平研究了革皮氏海參皂苷對骨髓細胞周期和凋亡的影響，進一步探討海參皂苷促進骨髓抑制模型小鼠造血功能恢復的分子機制。

1 材料

1.1 海參 革皮氏海參(Pearsonothuria graeffei)，購于青島南山市場，中國科學院海洋研究所研究員廖玉麟對其進行種屬鑒定。

1.2 實驗動物 健康♂ ICR小鼠，18～20 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為 SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)溫度22～24℃，相對濕度52% ～58%，12:12 h明暗交替。

1.3 主要試劑 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)，為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品;碘化丙碇(propidium iodide，PI)、羧甲基纖維素，由Sigma公司提供;TRIzol Reagent，Invitrgen 產(chǎn) 品;TaqDNA 聚合酶、dNTPs、RNase Free水、DNA Marker DL2000，為 TaKaRa產(chǎn)品;M-MLV Reverse Transcriptase，為 Promega產(chǎn)品;AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，為瑞士羅氏公司產(chǎn)品;CyclinB1、bcl-2、bcl-xl及 β-actin上下游引物由上海生工生物技術有限公司合成;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 主要使用儀器 BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司;Mini-Protean電泳儀，日本 BIORAD公司;FACS.VAN.TAGE流式細胞儀，美國BD公司產(chǎn)品;GL-20M型高速冷凍離心機，上海盧湘離心機儀器有限公司;TC-96 Life Pro基因擴增儀，杭州博日科技有限公司;DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠;JS-780型全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 革皮氏海參皂苷的制備 革皮氏海參干品粉碎成粉，按1∶10(m/V)的料液比用體積分數(shù)60%的乙醇溶液提取。合并提取液，減壓濃縮，得到的流浸膏分散于水中，過HP-20型大孔樹脂柱，以80%乙醇洗脫，收集洗脫組分，減壓濃縮、真空冷凍干燥，得到革皮氏海參總皂苷。采用香草醛－冰乙酸比色法測定所得海參皂苷的純度為65.04%。臨用時用0.5%羧甲基纖維素配制。

2.2 動物分組及模型建立 ICR小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分為4組，每組10只。給藥組分別灌胃不同濃度的海參總皂苷溶液［分別為10和30 mg(kg·bw)－1］，正常對照組灌胃0.5%羧甲基纖維素，灌胃體積為0.01 ml(g·bw)－1，1 天 1 次，連續(xù) 16 d。除正常對照組外，其余3組均于首次給藥后第7 d，腹腔注射 Cy 100 mg·kg－1，1 天 1 次，連續(xù) 3 d，造模。于末次給藥2 h后，脫頸椎處死，無菌剝離股骨，備用。

2.3 骨髓有核細胞計數(shù) 參見文獻［7］方法，用5 ml 3%的醋酸溶液沖出髓腔內全部細胞，制成單細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)，計算出每根骨髓含有的有核細胞數(shù)。

2.4 流式細胞術檢測骨髓細胞周期分布 用5 ml生理鹽水沖出髓腔內全部細胞，制成單細胞懸液，收集1×106個細胞，經(jīng)PBS洗2次，用預冷的75%乙醇固定24 h。固定的細胞經(jīng)PBS洗滌2次，加入PI染液 (50 mg/L－1PI、0.1 g/L－1RNase A、0.1%Triton-X 100)，置4℃避光染色30 min，隨即進行流式細胞儀檢測細胞。每個樣本均獲取10 000個細胞，采用WinMDI 2.9軟件系統(tǒng)進行細胞周期分析。

2.5 流式細胞術檢測骨髓細胞凋亡率 取1×106個骨髓細胞，參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒方法處理后，采用流式細胞儀檢測。以未染色細胞調零，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管做為基準參照，測定每個上樣管數(shù)據(jù)，每個樣本均獲取10 000個細胞，用WinMD 2.8軟件進行分析。

2.6 對細胞周期調控基因cyclin B1和抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表達的影響 采用TRIzol法提取骨髓細胞總RNA。取1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，以逆轉錄反應所得cDNA為模板進行RTPCR反應。反應體系包括 cDNA 3 μl，MgCl2(25 mM)1.8 μl，10 × PCR buffers 3 μl，dNTP(10 mmol·L－1)1.2 μl，TaqDNA 聚合酶(5 U/μl)1 μl，10 μmol·L－1引物各 0.6 μl，以 RNase Free 水補足體積至30 μl。PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性45 s;退火30 s;72℃延伸45 s，循環(huán)結束后72℃延伸10 min。引物設計見Tab 1。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用 Image J(version 1.41o)圖像分析軟件分析各目的基因條帶的灰度值，以β-actin作內參校正，用目的基因灰度值與βactin灰度值的比值表示目的基因的相對表達量。

Tab 1 Primer sequences，length of products，annealing temperature and cycles of different genes

3 結果

3.1 對骨髓有核細胞數(shù)的影響 骨髓有核細胞數(shù)代表骨髓的造血能力。結果如Fig 1所示，模型對照組的骨髓有核細胞數(shù)降低，與正常對照組比較，降低了30.89%(P＜0.05)。灌胃低高劑量革皮氏海參總皂苷后，骨髓有核細胞數(shù)增加，與模型對照組比較，分別增加了42.32%和32.25%(P＜0.01，P＜0.05)。表明革皮氏海參總皂苷可有效減輕Cy對模型小鼠骨髓細胞抑制的作用，恢復骨髓造血功能。

Fig 1 Effect of saponins of P.graeffei on the number of BMC in mice

3.2 對小鼠骨髓細胞細胞周期分布的影響 結果如Tab 2所示，與正常對照組比較，模型小鼠骨髓細胞周期S期百分率上升，G2/M期百分率下降，說明環(huán)磷酰胺使骨髓細胞細胞周期發(fā)生S期阻滯。經(jīng)革皮氏海參總皂苷作用后，模型小鼠骨髓細胞周期分布發(fā)生改變，低、高劑量組小鼠S期骨髓細胞數(shù)較模型組分別降低了37.90%和25.86%，G2/M期分別提高了408.5%和221.6%。表明革皮氏海參總皂苷使骨髓細胞周期由S期向G2/M期轉變，促進骨髓細胞增殖。

Tab 2 Effects of saponins of P.graeffei on the cell cycle of BMC

3.3 對小鼠骨髓細胞凋亡的影響 結果如Fig 2所示，與正常對照組比較，模型小鼠骨髓細胞凋亡率明顯上升，為22.8%(P＜0.01)，說明環(huán)磷酰胺可誘導小鼠骨髓細胞凋亡。與模型對照組比較，低高劑量組小鼠骨髓細胞凋亡率明顯降低，分別為15.0%和11.2%(P＜0.01，P＜0.01)。表明，革皮氏海參總皂苷可明顯降低骨髓損傷小鼠骨髓細胞的凋亡率，且劑量效應關系明顯。

3.4 對小鼠骨髓細胞周期基因cyclin B1mRNA表達的影響 Cyclin B1是控制細胞進入G2/M期的關鍵因子。革皮氏海參總皂苷能上調模型小鼠骨髓細胞cyclin B1 mRNA的表達，且劑量效應關系明顯(見Fig 3)。與模型對照組比較，低、高劑量組小鼠cyclin B1 mRNA表達量分別升高了20.19%和82.35%(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3.5 對抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表達的影響 Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質，bcl-2對抗各種凋亡的刺激而對細胞起保護作用，bcl-xl通過阻止細胞色素C和凋亡誘導因子的釋放，從而阻止細胞凋亡。結果如Fig 3所示，與正常對照組比較，環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制小鼠的抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl表達量減低(P＜0.01，P＜0.01)，表明環(huán)磷酰胺可引起小鼠骨髓細胞凋亡。與模型對照組比較，皂苷低高劑量組小鼠的bcl-2和bcl-xl mRNA的表達增加，且劑量效應關系明顯。其中，低高劑量組bcl-2 mRNA的表達量分別提高了31.2%(P＜0.05)和58.1%(P＜0.01)，bcl-xl mRNA表達上調了24.4%(P＜0.01)和37.8%(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of saponins of P.graeffei on the apoptosis of BMC cells in mice

4 討論

本實驗采用流式細胞技術和分子生物學等手段研究了革皮氏海參總皂苷對環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制模型小鼠骨髓細胞生長的影響及其分子機制。結果表明，革皮氏海參總皂苷可增加骨髓有核細胞的數(shù)量，改善由環(huán)磷酰胺導致的S期阻滯，促進骨髓抑制模型小鼠骨髓細胞周期由S期向G2/M轉變，并進一步證明促進模型小鼠骨髓細胞周期基因Cyclin B1 mRNA的表達;而且革皮氏海參總皂苷可顯著降低模型小鼠骨髓細胞凋亡率，提高模型小鼠抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表達，提示革皮氏海參總皂苷可通過抑制骨髓細胞凋亡，促進骨髓細胞增殖而達到促進造血的目的。

骨髓細胞周期是反映造血系統(tǒng)造血功能的重要指標之一，細胞周期各個時相的分布情況可以反映骨髓細胞增殖的狀態(tài)。細胞周期的主要調節(jié)成分是細胞周期蛋白(cyclins)和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (cyclin dependent protein kinases，CDKs)。細胞周期蛋白 cyclin B1［8－11］與細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDKs結合，受磷酸化、去磷酸化調節(jié)，所形成的活性復合物能轉位入核，磷酸化其核內底物，促進細胞的G2/M期轉變。王勇等［12］報道，人參總皂苷可促進骨髓細胞由相對靜止期G0/G1期進入增殖活躍期G2/M期。另有研究表明，紅景天苷促使骨髓抑制貧血小鼠骨髓細胞從S期向G2/M期轉化。提示皂苷類物質可抑制由環(huán)磷酰胺引起的S期阻滯。

Fig 3 Effect of saponins of P.graeffei on mRNA expression of cyclinB1，bcl-xl and bcl-2 in BMC

Bcl-2蛋白家族是調節(jié)細胞凋亡的主要基因蛋白，分為抗凋亡(bcl-2、bcl-xl等)和促凋亡(bax、bad 等)兩大亞家族［13］。bcl-2［14］能抑制極廣泛的凋亡因素引發(fā)的凋亡，延長細胞壽命。bcl-xl［15－16］參與負調控線粒體介導的細胞凋亡過程，通過與Bcl-2家族促凋亡蛋白形成異源二聚體，影響后者的促凋亡作用，從而最終阻止線粒體釋放細胞色素C起到抑制細胞凋亡的作用。研究證實［17］，抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl表達增強，可抑制由環(huán)磷酰胺造成的骨髓細胞凋亡，實現(xiàn)對骨髓抑制小鼠骨髓細胞增殖和修復的目的。

綜上所述，革皮氏海參總皂苷促進骨髓抑制小鼠造血功能的恢復。其作用途徑可能通過調節(jié)骨髓細胞周期分布，提高細胞周期蛋白cyclin B1的表達水平，刺激造血細胞增殖，并通過提高抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表達，抑制造血細胞凋亡。

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