王德國，王 新，劉 玉，王 星，邢 文，李祥東，楊 勝，王安才，孫賢林

(1.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院老年心血管科，安徽蕪湖 241001;2.安徽省立醫(yī)院心臟科，安徽合肥 230001)

心肌細(xì)胞間縫隙連接(gap junction，GJ)是電沖動(dòng)的快速傳導(dǎo)通路，主要分布在心肌細(xì)胞端－端連接處。當(dāng)心肌缺血時(shí)，Cx43表達(dá)降低、向心肌細(xì)胞側(cè)邊分布，嚴(yán)重影響電傳導(dǎo)，是心律失常發(fā)生的主要機(jī)制之一［1］。最近，Shaw 等［2］發(fā)現(xiàn)微管系統(tǒng)是細(xì)胞Cx43快速運(yùn)輸并裝配到閏盤部位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在心肌缺血或者氧化應(yīng)激時(shí)，導(dǎo)致Cx43在細(xì)胞側(cè)邊分布和無序分布，細(xì)胞間電傳導(dǎo)相應(yīng)減慢［3］。Taxol作為一種微管穩(wěn)定劑，可促進(jìn)缺氧狀態(tài)下微管的聚合［4－5］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察微管穩(wěn)定劑Taxol是否參與心肌缺血損傷的導(dǎo)致的Cx43重構(gòu)，探討穩(wěn)定劑Taxol能否作為新的抗心律失常藥物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 AnaeroPack安寧包厭氧培養(yǎng)袋中(日本三菱公司)，Langendorff灌注裝置(南京美易科技有限公司)，電泳槽及電泳儀(美國BIORAD公司)，共聚焦顯微鏡(德國Zeiss);Taxol購自于Sigma公司，兔抗鼠Cx43抗體(Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將分離的大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為8組，以臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率。(1)對(duì)照組:細(xì)胞靜置120 min;(2)缺氧組:心肌細(xì)胞低氧120 min;(3)Taxol干預(yù)組:在缺氧前給予不同濃度的 Taxol(0.1、1 、10、100、1、10 nmol·L－1)，其余同缺氧組。

1.2.2 用酶解法分離大鼠心室肌細(xì)胞［6］大鼠斷頸處死后取出心臟，4℃氧飽和Tyrode液洗凈血液，Langendorff恒流灌流(37℃)，流速10 ml·min－1，并以純O2飽和。無鈣Tyrode液灌流5 min后再以I型膠原酶0.3 g·L－1的無鈣 Tyrode液灌流消化10 min。隨之將心室肌剪碎，于含0.1%BSA的無鈣Tyrode液中37℃孵育15 min，細(xì)胞懸液用200 μm的尼龍網(wǎng)過濾，濾液在無鈣Tyrode液中逐步復(fù)鈣至Ca2+濃度為1.25 mmol·L－1。無鈣 Tyrode液成分(mmol·L－1):NaCl 100.0，KCl 10.0，KH2PO41.2，MgSO45.0，葡萄糖20.0，?；撬?0.0，MOPS 10.0(pH 7.4)。

Tab 1Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on cell viability exposed to hypoxic condition(±s，n=8)

Tab 1Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on cell viability exposed to hypoxic condition(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P＜0.05 and##P ＜0.01 vs hypoxic group(0 nmol·L－1Taxol)

－1 0.1 1 10 100 1000 10000 Rod cells numbers 123±23 35±11＊＊ 45±14＊＊ 66±21＊＊## 84±26＊＊## 53±22＊＊# 42±12＊＊ 37±11 Control Taxol/nmol·L 0＊＊Cell viability(%)78±12 23±11＊＊ 34±12＊＊ 42±12＊＊## 53±13＊＊## 38±9＊＊## 35±10＊＊# 28±11＊＊

1.2.3 心肌細(xì)胞低氧模型 取分離的心肌細(xì)胞懸液1 ml，加入到16孔培養(yǎng)板中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將缺氧及干預(yù)組細(xì)胞放到AnaeroPack安寧包厭氧培養(yǎng)袋中，其中的氧清除劑能迅速將O2通過轉(zhuǎn)換為CO2，從而使氧濃度降低到1%以下，氧指示劑由藍(lán)色變?yōu)闊o色［7］。厭氧靜置120 min作為缺氧模型。缺氧120 min后，在倒置顯微鏡下觀察每個(gè)高倍視野下的桿狀心肌細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 心肌細(xì)胞存活率的測(cè)定 吸取各組心肌細(xì)胞懸液到96孔培養(yǎng)板，以0.4%臺(tái)盼藍(lán)排斥反應(yīng)來判斷心肌細(xì)胞存活率，死亡的細(xì)胞呈藍(lán)色，存活的細(xì)胞則不著色，在顯微鏡下每個(gè)樣品記數(shù)400個(gè)心肌細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)在顯微鏡下觀察每個(gè)高倍視野下的桿狀心肌細(xì)胞數(shù)目［6］。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)單個(gè)心肌細(xì)胞Cx43分布［7］吸取少量心肌細(xì)胞滴到載玻片上，加入4%多聚甲醛固定5 min，熱風(fēng)吹干，PBS液輕洗細(xì)胞3次，滴加10%山羊血清封閉非特異性抗原(30 min)，滴加1∶200抗Cx43單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗后滴加TRTC標(biāo)記的抗兔抗鼠二抗，37℃ 30 min，DAPI染核5 min，PBS洗后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察切片。

1.2.6 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞 Cx43蛋白表達(dá)［7］將各組心肌細(xì)胞離心、裂解、離心以提取總蛋白質(zhì)。采用12%分離膠及5%濃縮膠進(jìn)行SDSPAGE電泳。PVDF膜和凝膠在冰浴條件下60 mA恒流電轉(zhuǎn)1 h。將PVDF膜在1%BSA 4℃封閉過夜。加入一抗工作液(1∶1 000)，37℃孵育1 h。加入HRP標(biāo)記的二抗工作液(1∶2 000)，37℃孵育1 h。加入TCL發(fā)光液顯色、曝光、掃描保存。Image J圖像分析軟件定量分析Cx43表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 微管穩(wěn)定劑對(duì)缺氧心肌細(xì)胞存活的影響 缺氧時(shí)心肌細(xì)胞明顯受損，細(xì)胞存活率明顯降低，鏡下計(jì)數(shù)示桿狀心肌細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.01)。Taxol在0.1～10 nmol·L－1濃度下成劑量依賴性地提高桿狀細(xì)胞數(shù)，提高心肌細(xì)胞存活率，而100 nmol·L－1～10 μmol·L－1濃度下桿狀細(xì)胞數(shù)開始減少，細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.01)。

2.2 微管穩(wěn)定劑對(duì)缺氧心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響 如Fig 1所示，缺氧條件下，心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)下降，0.1～10 nmol·L－1濃度范圍內(nèi)的Taxol呈劑量依賴性地改善心肌細(xì)胞的Cx43表達(dá)，但 100 nmol·L－1～ 10 μmol·L－1的濃度范圍內(nèi)的Taxol則抑制心肌Cx43。

Fig 1 Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on Cx43 expression of cardiac myocytes exposed to hypoxic condition.(±s，n=8)

2.3 微管穩(wěn)定劑對(duì)缺血心肌細(xì)胞Cx43分布的影響 如Fig 2所示，非缺氧組心室肌細(xì)胞Cx43(紅色)主要分布在心肌細(xì)胞的兩端的閏盤處(A)，當(dāng)心肌細(xì)胞缺氧120 min，細(xì)胞側(cè)邊出現(xiàn)Cx43分布(B)。0.1～10 nmol·L－1濃度范圍內(nèi)的Taxol呈劑量依賴性地抑制側(cè)邊 Cx43(C、D、E)，100 nmol·L～1－10 μmol·L－1的濃度范圍內(nèi)(F、G、H)，心肌細(xì)胞兩端Cx43也明顯受到抑制。

3 討論

缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及功能障礙，微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分，影響心肌細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和功能。Taxol作為一種微管穩(wěn)定劑，主要位點(diǎn)是微管蛋白/微管系統(tǒng)，它能促進(jìn)微管聚合，抑制微管解聚［8－9］。本研究以離體心肌細(xì)胞缺氧模型，觀察電傳導(dǎo)重要離子通道Cx43在缺氧下的表達(dá)與分布情況，并以不同劑量的微管穩(wěn)定劑干預(yù)，觀察其細(xì)胞毒性及對(duì)Cx43的穩(wěn)定作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的Taxol可明顯減輕缺氧所致的心肌細(xì)胞死亡，維持細(xì)胞的桿狀結(jié)構(gòu)。有研究顯示Taxol可明顯維持缺氧條件下的心肌Ca2+-ATPase活性，并減輕心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度［10］。對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)的保護(hù)作用可能是Taxol降低細(xì)胞死亡的原因之一。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)大劑量的Taxol明顯增加缺氧心肌細(xì)胞的壞死和攣縮。但具體毒性機(jī)制不甚清楚，可能與大劑量的Taxol抑制了心肌細(xì)胞的能量代謝及信號(hào)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

Cx43組成的心肌細(xì)胞間縫隙連接是快速電傳遞通道，在心律失常產(chǎn)生機(jī)制中具有重要作用。心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞的Cx43分布紊亂，表達(dá)量降低，心肌閏盤連接處的Cx43分布減少，而細(xì)胞質(zhì)及心肌細(xì)胞的側(cè)邊(非閏盤區(qū)域)Cx43分布增加。最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞見電傳導(dǎo)延緩，從而參與折返性心律失常的發(fā)病機(jī)制［7］。迄今為止Cx43重新分布的原因并不完全清楚。最近研究顯示微管正端結(jié)合蛋白(EB1)促進(jìn)微管穩(wěn)定，引導(dǎo)Cx43定向轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，并組裝成縫隙連接，從而形成心肌細(xì)胞間的快速電連接［2］。心肌應(yīng)激狀態(tài)下，Cx43不能定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞連接處形成縫隙連接，去除應(yīng)激或使用抗氧化應(yīng)激均可降低Cx43和EB1向胞質(zhì)內(nèi)分布。同樣，EB1表達(dá)抑制同樣造成Cx43不能正確的定向裝配。適時(shí)熒光共聚焦顯微鏡可清楚觀察到EB1向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與Cx43側(cè)化、微管紊亂同步改變［3］。

本研究顯示低劑量Taxol呈劑量依賴性地減輕心肌細(xì)胞缺氧所致的Cx43表達(dá)抑制，形態(tài)學(xué)觀察可見Taxol可明顯抑制缺氧所致的Cx43側(cè)邊分布。這提示微管穩(wěn)定性參與缺氧條件下Cx43的重新分布，對(duì)缺血性心律失常具有潛在影響［10］。由于縫隙連接重構(gòu)在缺血性心臟病心律失常機(jī)制中扮演很關(guān)鍵角色，因此低劑量的Taxol有可能具有抗心律失常作用。另外，本研究也觀察到大劑量的Taxol則明顯抑制心肌Cx43表達(dá)，并進(jìn)一步抑制細(xì)胞閏盤處的Cx43分布，其機(jī)制可能是抑制了Cx43的蛋白合成。

Fig 2 Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on Cx43 distribution of cardiac myocytes exposed to hypoxic

綜上所述，低劑量Taxol可減輕缺氧所致的心肌細(xì)胞損傷，維持細(xì)胞的桿狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)穩(wěn)定Cx43在心肌閏盤處的分布，具有潛在的抗心律失常作用。但大劑量Taxol具有明顯的細(xì)胞毒性，在進(jìn)行整體實(shí)驗(yàn)中需要控制用量和速度。

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