郭晶晶 單立冬 吳 鋼

1.上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院普外科，上海 200431；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)與醫(yī)學(xué)心理學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；3.上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科，上海 200040

5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細(xì)胞周期的S期摻入到增殖或分裂細(xì)胞的核內(nèi)，只要細(xì)胞不消亡，BrdU將永久地存留在胞核DNA中，且在體或離體都能通過免疫組織化學(xué)的方法檢測到，可用于標(biāo)記BrdU暴露期間進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞[1]。故BrdU陽性細(xì)胞可被看作是具有增殖活性的細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：SD大鼠，雌雄不拘，體重220～230 g，蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。試劑：BrdU（Roche Diagnostic Co.）。

1.2 分組

踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動對成年大鼠海馬齒狀回細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)分兩組，①踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動組：轉(zhuǎn)輪速度為10 m/min，每天訓(xùn)練2 次（09:00，15:00），每次訓(xùn)練 30 min，連續(xù) 6 d；②對照組：動物置于轉(zhuǎn)輪中，速度為0。放置次數(shù)與時(shí)間同運(yùn)動組。在染色過程中每一組又分為三個亞組，分別為加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組。

1.3 BrdU標(biāo)記

踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動的第4天開始給藥，于每次運(yùn)動前1 h腹腔注射 BrdU（50 mg/kg，美國 ROCHE 公司），2 次/d，連續(xù) 3 d。 末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3～5.1 mm作連續(xù)冰凍切片，進(jìn)行BrdU染色。

1.4 BrdU免疫組織化學(xué)

切片經(jīng)2 mol/L HCl（室溫30 min）變性，用0.01 mol/L PBS充分漂洗后轉(zhuǎn)入0.1%胰酶中（37℃15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分別加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組，室溫下30 min,然后加入小鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶200，Biosource）室溫孵育 16h，0.01mol/L PBS 漂洗（5min×3次），轉(zhuǎn)入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室溫孵育 2 h，再用 0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入親和素生物素試劑（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室溫孵育 2 h，最后用含0.03%H2O2的0.05%DAB 顯色 3～5 min，0.01 mol/L PBS終止顯色。常規(guī)脫水、透明、封片。鏡檢BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

隨機(jī)選取每只大鼠位置相同的5張不連續(xù)切片，光學(xué)顯微鏡下 （×200）計(jì)數(shù)每張切片雙側(cè)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層（granular cell layer，GCL）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞的均數(shù)作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。用SPSS 10.0軟件作方差分析（one-way ANOVA）檢測組間差異性。

2 結(jié)果

2.1 踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動對成年大鼠齒狀回細(xì)胞增殖的作用

經(jīng)過6 d的踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動訓(xùn)練后，各組BrdU陽性細(xì)胞見圖1。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，對照組為（22.55±1.91）個/切片，踏轉(zhuǎn)輪組為（57.89±1.90）個/切片，兩組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。由此可見，踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動可增加BrdU陽性細(xì)胞，促進(jìn)齒狀回細(xì)胞增殖。

圖1 踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動6 d后海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)

2.2 不同的封閉液對組織片染色效果的影響

末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3～5.1 mm作連續(xù)冰凍切片，將切片隨機(jī)分成三組。在染色過程中，這三組分別加入羊血清、胰酶抑制劑和牛血清白蛋白作為封閉液和終止胰酶作用的抑制劑。各組BrdU陽性細(xì)胞如圖2所示。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，三種方法均能使BrdU著色，但各組的本底顏色和非特異性著色程度不同：羊血清組中雖然陽性細(xì)胞與非特異性著色細(xì)胞有明顯區(qū)別，但非特異性著色細(xì)胞顯色度較深，且遍布整個視野。胰酶抑制劑組陽性細(xì)胞與非特異性著色細(xì)胞也有明顯差異，而且非特異性著色細(xì)胞顯色度較淺，整個本底相對較為干凈、清爽。牛血清白蛋白組幾乎見不到非特異性著色細(xì)胞，本底顏色非常淡。

除了本底顏色和非特異著色的觀察外，筆者還重點(diǎn)觀察了組織切片的破損情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：牛血清白蛋白和胰酶抑制劑組無切片破損，而羊血清組有少部分腦片破損。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：羊血清組為（23.22±2.38）個/切片，胰酶抑制劑組為（22.54±2.12）個/切片，牛血清白蛋白組為（23.14±3.12）個/切片，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

圖2 不同封閉液對BrdU免疫組織化學(xué)染色效果的影響

自從20世紀(jì)末神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以來，其目前已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。而研究在體或移植后的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化中常用的標(biāo)記新生細(xì)胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前兩者在細(xì)胞增殖時(shí)整合入細(xì)胞以后，即使在細(xì)胞靜止期仍能表達(dá)；后兩者是細(xì)胞增殖過程中表達(dá)的內(nèi)源性蛋白，當(dāng)細(xì)胞處于靜止期時(shí)，它們并不表達(dá)。因此，BrdU和3H是常用的追蹤細(xì)胞的標(biāo)記物，而BrdU的檢測又較3H更為方便、簡單，所以BrdU是最為常用的標(biāo)記細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。

豐富環(huán)境對神經(jīng)發(fā)生有影響，而在各種環(huán)境因素中，運(yùn)動對其影響較為顯著[4-5]。本課題的前期研究建立了踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動的模型[6]，并發(fā)現(xiàn)運(yùn)動對神經(jīng)發(fā)生的作用具有強(qiáng)度依賴性，這早于國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道[7-8]。故本課題選用運(yùn)動作為促進(jìn)細(xì)胞增殖的方法，觀察了不同的染色方法對切片及結(jié)果的影響。

組織切片BrdU染色時(shí)，常用的方法有貼片法和漂片法。漂片法與貼片法相比有一定的優(yōu)點(diǎn)：前者能使抗體從兩側(cè)滲透，更有利于抗體與抗原充分反應(yīng)，相應(yīng)的在洗片時(shí)，也能使未結(jié)合的抗體充分漂洗干凈；漂片法比貼片法所使用的抗體數(shù)量少，而且必要時(shí)抗體還可以回收，重復(fù)利用。標(biāo)本量大時(shí)，漂片法比貼片法更省時(shí)、省力。但是，用漂片法進(jìn)行BrdU染色時(shí)，由于在加入抗體前要用鹽酸和胰酶對腦片進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)過處理（尤其是胰酶處理）后，進(jìn)行染色的腦片極易破損，從而導(dǎo)致整個染色過程無法正常完成，或最終所得到的腦片極少。因此，在本實(shí)驗(yàn)中針對胰酶的消化作用，筆者分別選用了與二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制劑來抑制（或終止）胰酶的消化作用。

羊血清是免疫組織化學(xué)中常用的封閉液，但是，在本實(shí)驗(yàn)中并未取得預(yù)期的成果，雖然羊血清能終止胰酶的消化作用，但并未能有效地封閉非特異性染色。其原因目前仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。胰酶抑制劑（取自火雞蛋清）組和牛血清白蛋白組非特異性染色較少，尤其是牛血清白蛋白組。其原因可能是二者的成分單一，純度較高。

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