段寶奇，劉 憶，胡 靜，高覺民

(江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)外科1、血液凈化中心2，江蘇 南京 210029)

難治性顳葉癲癇易引起早逝、外傷、精神病、認(rèn)知障礙等嚴(yán)重后果[1]，多需要手術(shù)切除海馬，雖然諸多學(xué)者對海馬神經(jīng)元改變致耐藥難治等進(jìn)行廣泛研究，但關(guān)于海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞在其中的作用研究較少。本文通過免疫組化、免疫印跡法(Western blot)、原位末端標(biāo)記(TUNEL)方法檢測P-gp、p53和細(xì)胞凋亡在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，探討其在難治性顳葉癲癇患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 17例難治性顳葉癲癇手術(shù)患者為2005年4月至2011年8月在我科手術(shù)的患者，其中男性7例，女性10例，年齡8～36歲，平均23.5歲，病程3～32年，平均10.5年。所有患者均正規(guī)服用抗癲癇藥物治療兩年以上，仍不能控制發(fā)作，平均每個(gè)月發(fā)作>3次。術(shù)前患者均進(jìn)行了長程視頻腦電圖檢測棘波定位于顳葉；頭部MR檢查符合海馬硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；癲癇血藥濃度檢測在有效濃度范圍；均在皮層和深部電極監(jiān)測下行前顳葉切除術(shù)。對照組為手術(shù)內(nèi)減壓治療嚴(yán)重顱腦外傷3例和半球腦梗塞2例，均無癲癇發(fā)作史。所有患者均有患者或家屬簽署手術(shù)同意書。

1.2 標(biāo)本 手術(shù)切除的每例腦組織標(biāo)本均留取部分放入液氮保存?zhèn)溆?，其余?%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切成6 μm厚的切片，備行免疫組化和凋亡檢測。

1.3 主要試劑 P-糖蛋白抗體購自Santa Cruz公司；p53抗體、β-action和二抗購自武漢博士德公司；原位末端標(biāo)記檢測細(xì)胞凋亡(TUNEL)試劑盒由Roche公司提供；即用型快速免疫組化MaxVision試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑等購自福州邁新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 采用即用型快速免疫組化MaxVision試劑盒。分別加入P-gp、p53一抗，37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次，滴加MaxVision二抗，37℃或室溫孵育10～15 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。P-gp在胞膜和胞漿、p53在胞核染成黃色或棕色為陽性。在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，重復(fù)5次，取其均值。

1.2.2 凋亡細(xì)胞檢測 使用TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測，按說明書操作，以細(xì)胞核染成紫褐色為陽性。在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，重復(fù)5次，取其均值。

1.2.3 免疫印跡法 取出液氮保存的腦組織標(biāo)本，在冰浴下用玻璃研磨器磨碎，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞1 h；4℃下12 000 r/min離心20 min，取上清后采用Bradford比色法進(jìn)行蛋白定量。取等量的蛋白樣品，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)運(yùn)于硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，洗膜后分別與一抗P-gp(1:500)、p53(1:200)及β-抗體(1:6000)孵育4℃過夜，次日TBST洗脫5 min共3次，加HRP標(biāo)記的二抗(1:400)孵育2 h。加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑中反應(yīng)數(shù)分鐘，最后以高效顯影膠片曝光并沖洗膠片。Labworks軟件分析結(jié)果時(shí)以蛋白條帶作為內(nèi)參照。計(jì)算P-gp、p53蛋白條帶及β白條帶與內(nèi)參照蛋白條帶像素灰度的百分比值，作為蛋白表達(dá)的相對水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P-gp免疫組化 對照組P-gp只在微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組微血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分星形膠質(zhì)細(xì)胞膜都有表達(dá)(圖1)。

圖1 P-gp免疫組化(×200)

2.2 p53免疫組化 對照組未見明顯p53陽性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組有14例可見p53陽性細(xì)胞，主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞，少部分神經(jīng)元細(xì)胞(圖2)。

圖2 p53免疫組化(×200)

2.3 TUNEL 對照組未見凋亡陽性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組可見凋亡陽性細(xì)胞，主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞，少數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞(圖3)。

圖3 TUNEL(×200)

2.4 Western blot分析 P-gp和p53在癲癇患者中表達(dá)較對照組明顯增高(圖4、圖5)。

圖4 Western blot分析

圖5 Western blot分析

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 顯微計(jì)數(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組P-gp、p53免疫組化和凋亡陽性細(xì)胞較對照組明顯增加；Western blot分析提示實(shí)驗(yàn)組P-gp、P53較對照組表達(dá)明顯增加，結(jié)果見表1。

表1 兩組免疫組化(p53、P-gp)、TUNEL、Western blot結(jié)果(±s)

表1 兩組免疫組化(p53、P-gp)、TUNEL、Western blot結(jié)果(±s)

注：t檢驗(yàn)，P<0.05。

組別對照組實(shí)驗(yàn)組17例數(shù)5 P-gp 0 13.84±7.73 P53 0 10.47±7.52 TUNEL 0 5.82±3.41 P-gp 0.72±0.14 1.43±0.42 P53 0.37±0.16 1.26±0.37 Western blot

3 討論

顳葉癲癇多為難治性癲癇，即表現(xiàn)出對多種抗癲癇藥物耐藥，人們發(fā)現(xiàn)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體與耐藥相關(guān)，其中又以P-gp的作用為著。P-gp是多耐藥基因編碼的170 kD膜蛋白，在正常腦組織中主要在微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，可阻止內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，成為血腦屏障作用的一部分，許多抗癲癇藥物也是其作用底物而被排出細(xì)胞膜外。癲癇發(fā)作可以造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血腦屏障被破壞，進(jìn)而構(gòu)成第二道屏障的膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，也高表達(dá)P-gp。從本組實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組免疫印跡法顯示P-gp較對照組有更高的表達(dá)；而免疫組化顯示除血管內(nèi)皮細(xì)胞外有部分星形膠質(zhì)細(xì)胞P-gp陽性，對照組未見陽性P-gp膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞P-gp高表達(dá)，可進(jìn)一步限制抗癲癇藥物作用于異常放電的神經(jīng)元[2]，促成癲癇耐藥難治。

難治性顳葉癲癇多有海馬神經(jīng)元丟失、凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，本組實(shí)驗(yàn)我們也有相似發(fā)現(xiàn)。同時(shí)免疫組化和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組膠質(zhì)細(xì)胞較對照組有明顯的p53高表達(dá)，這與Engel等[3]、Xu等[3]報(bào)道結(jié)果一致。而TUNEL發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞較神經(jīng)元凋亡明顯，這可能是由于：(1)腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞的20～50倍，而硬化海馬組織中神經(jīng)元丟失較多，使神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞比例進(jìn)一步下降，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組可見的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少。(2)癲癇患者的硬化海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞以壞死為主要方式，凋亡可能是次要原因[4]。(3)癲癇發(fā)作多伴有腦組織的缺氧，而在體條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元更易受損；且海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元更易發(fā)生凋亡；同時(shí)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞化后，星形膠質(zhì)細(xì)胞更容易發(fā)生死亡[5]。結(jié)合本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為調(diào)控細(xì)胞凋亡的p53在星形膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)，也支持星形膠質(zhì)細(xì)胞較神經(jīng)元細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。

隨著分子生物學(xué)的研究深入，人們在癲癇研究中發(fā)現(xiàn)P-gp、p53與凋亡之間有密切關(guān)系。如Morrison等[6]發(fā)現(xiàn)敲除p53的小鼠可以減少癲癇發(fā)作導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，并認(rèn)為缺少p53在癲癇發(fā)作中有減少凋亡作用，p53參與了凋亡的調(diào)控。而Engel等[3]發(fā)現(xiàn)在顳葉癲癇患者海馬組織內(nèi)p53表達(dá)上升和凋亡表現(xiàn)，并認(rèn)為癲癇后受損細(xì)胞可以通過p53途徑誘導(dǎo)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)p53也參與了P-gp的調(diào)控[7]，如表達(dá)P-gp的MDR-1下游啟動(dòng)子有p53的結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)P-gp表達(dá)；p53還可以與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ETS-1協(xié)同作用或者通過對核因子R33等多種細(xì)胞因子做出反應(yīng)而增加P-gp的表達(dá)，雖然其中可能有p53變異的結(jié)果，但野生型p53也同樣具有類似的作用。動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)癲癇可以促使p53和P-gp的表達(dá)，同樣癲癇患者中P-gp表達(dá)明顯加強(qiáng)[2]。結(jié)合本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為由于癲癇的反復(fù)發(fā)作，腦組織膠質(zhì)細(xì)胞受到應(yīng)激、缺氧等損傷信號(hào)的作用，p53水平首先增加，從而提高P-gp的表達(dá)，以抵抗損傷的影響，但是P-gp的增加卻導(dǎo)致了癲癇耐藥；當(dāng)損傷刺激反復(fù)并達(dá)到細(xì)胞難以修復(fù)時(shí)，則p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，則其對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)、營養(yǎng)修復(fù)作用減弱，這都導(dǎo)致了難治性癲癇的形成。

本實(shí)驗(yàn)把p53對P-gp和凋亡的作用聯(lián)系起來，可能反映了以p53為調(diào)控通路的癲癇動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)以上變化發(fā)生在膠質(zhì)細(xì)胞，所以膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇的作用及是否可以通過調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞功能協(xié)同治療癲癇值得深入研究。

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