吳曉玲，廖燕萍，朱 錚

筆者發(fā)現(xiàn)，在藥品大腸菌群檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)中，按2010年版《中國(guó)藥典(一部)》以24 h產(chǎn)酸產(chǎn)氣特征作為判斷依據(jù)，某些中成藥制劑若含有較弱的抑菌成分(抑菌性較強(qiáng)應(yīng)改變檢驗(yàn)方法)，膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管的產(chǎn)氣就難以觀察，但培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)氣明顯，利于觀察。因此，筆者收集了幾種抑菌較弱和無(wú)抑菌作用的中藥制劑，通過(guò)乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、borth medium E 4種培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)。其中，乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基是 GB/T 4789.5－003及2010年版《中國(guó)藥典》中收載的大腸菌群檢查法使用的培養(yǎng)基，膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)是2005年版《中國(guó)藥典》中大腸菌群檢查法使用的培養(yǎng)基，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯是GB/T 4789.5－2011大腸菌群檢查使用的培養(yǎng)基，borth medium E為德國(guó)默克公司生產(chǎn)的進(jìn)口培養(yǎng)基。以上試驗(yàn)都通過(guò)24，48 h培養(yǎng)后觀察其結(jié)果，以探討大腸菌群檢查用培養(yǎng)基的靈敏度。

1 儀器與材料

PYX－DHS型60×75培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);BSC－1100IBS2型生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)。膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)為080604);乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)為070830);月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)為080521);borth medium E(德國(guó)Merck公司);0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(自制);pH=7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨水緩沖液(北京三藥有限公司)。香連丸(廈門(mén)中藥廠，批號(hào)為080403);萸連片(福建省安溪制藥有限公司，批號(hào)為20090101);銀蜜片(三明市三真藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20070704);大七厘散(廈門(mén)中藥廠，批號(hào)為080303)。大腸埃希菌[CMCC(B)44102]購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組

按2010年版《中國(guó)藥典(一部)》中大腸菌群檢查法[2]，取1∶10的供試液1 mL，分別加入到裝有膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、borth medium E培養(yǎng)基各10 mL的管中加有小倒管，每種培養(yǎng)基接種6支，分3組，每組2支，分別加入含10～20個(gè) /mL、40～60個(gè)/mL、80～100個(gè) /mL的大腸埃希菌1 mL(以計(jì)數(shù)為準(zhǔn))。

2.2 試驗(yàn)菌陽(yáng)性對(duì)照組

同2.1項(xiàng)下方法操作，每種培養(yǎng)基接種6支，分3組，每組2支，不加供試液，分別加入含 10～20個(gè)/mL，40～60個(gè)/mL，80～100個(gè)/mL的大腸埃希菌1 mL(以計(jì)數(shù)為準(zhǔn))，作為試驗(yàn)菌陽(yáng)性對(duì)照組。

2.3 供試品對(duì)照組

同2.1項(xiàng)下方法操作，每種培養(yǎng)基接種6支，分3組，每組2支，不加試驗(yàn)菌，分別加入1∶10的供試液1 mL，作為供試品對(duì)照組。將各接種后的培養(yǎng)基管置35～37℃環(huán)境培養(yǎng)18，24，48 h，觀察各培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣的情況。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

4種培養(yǎng)基加入樣品及大腸埃希菌液，在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。大腸埃希菌在膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管中呈產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象;由于月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、borth medium E培養(yǎng)基中未加入指示劑，因此大腸埃希菌加入后不變色，只有產(chǎn)氣現(xiàn)象。每種樣品均試驗(yàn)3次，在24 h內(nèi)3次結(jié)果可能不同，以“/”表示，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種培養(yǎng)基大腸埃希菌生長(zhǎng)情況

3 討論

在藥品的大腸菌群檢查中，藥品本身成分的抑菌性、對(duì)照菌液的濃度、敏感性、試驗(yàn)中試管中的沉淀物及培養(yǎng)基靈敏度等因素均能影響檢驗(yàn)結(jié)果[1]，本試驗(yàn)僅采用不同種培養(yǎng)基，不改變其他試驗(yàn)條件，比較培養(yǎng)基的靈敏度。

從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，不含抑菌成分的中成藥(銀蜜片、大七厘散)加菌培養(yǎng)24 h后，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、borth medium E產(chǎn)氣，膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基均產(chǎn)酸產(chǎn)氣。含較弱抑菌成分的中成藥(香連丸、萸連片)加菌培養(yǎng)18 h，borth medium E全部產(chǎn)氣，培養(yǎng)28 h后月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯產(chǎn)氣，40 h后乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣，48 h后膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

4種不同的培養(yǎng)基比較，borth medium E靈敏度最高，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基次之，膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基靈敏度最低。

從表1可見(jiàn)，加入到供試液內(nèi)的大腸埃希菌分別為10～20個(gè)/mL，40～60個(gè)/mL，80～100個(gè)/mL時(shí)，產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)氣的差別不顯著，即在2010年版《中國(guó)藥典(一部)》控制菌規(guī)定的10～100個(gè)/mL范圍內(nèi)，已可保證檢出率。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于中成藥供試液中多含有藥渣等沉淀物，加入試驗(yàn)菌培養(yǎng)24 h后，小倒管口被沉淀物堵塞，有的樣品小倒管內(nèi)無(wú)小氣泡，只有液面上有小氣泡產(chǎn)生，輕輕拍打試管壁有小氣泡上浮至液面，有的樣品小倒管內(nèi)及液面均無(wú)小氣泡或氣泡難以觀察，但培養(yǎng)48 h后，液面上均有大量氣泡，小倒管內(nèi)或多或少有氣泡填充，有弱抑菌作用的樣品產(chǎn)氣差異尤為明顯。因此，48 h培養(yǎng)較24 h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣更為明顯，有利于觀察。此現(xiàn)象說(shuō)明，樣品本身的作用使加入的試驗(yàn)菌受到抑制，培養(yǎng)48 h后菌細(xì)胞可得到修復(fù)并生長(zhǎng)繁殖。因此，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藥品檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性非常重要。

綜上所述，2010年版《中國(guó)藥典(一部)》大腸菌群檢查法采用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基較合適，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯亦可，建議大腸菌群檢查培養(yǎng)時(shí)間由24 h延長(zhǎng)至48 h，以利于細(xì)菌的檢出。

[1]趙 勤.提高藥品中大腸菌群檢出率的初步探討[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，25(6):1 009 － 1 012.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄ⅩⅢC.