伍 蓉，劉融融，萬(wàn) 莉

紅霉素腸溶膠囊為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，作為治療對(duì)青霉素過(guò)敏感染患者的替代用藥。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]為抗生素微生物檢定法，此方法煩瑣費(fèi)時(shí)、影響因素多。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定紅霉素腸溶膠囊中紅霉素的含量，簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確可靠，為該制劑的質(zhì)量控制提供了新的測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津公司LC－20A型高效液相色譜儀(LC－20AT泵，SIL－20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO－20A柱溫箱，SPD－20A紫外檢測(cè)器);賽多利斯公司 CP224S型電子天平(最大值210 g;d=0.1 mg)，ME235S型電子天平(最大值210 g;d=0.01 mg)。紅霉素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為130307－200716，含量為93.5%);紅霉素腸溶膠囊(天圣制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為 101104，101223，110101，110305，110517，規(guī)格為 0.25 g);甲醇、乙腈為色譜純;水為重蒸餾水;其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.067 mol/L磷酸二氫銨溶液(用三乙胺調(diào)pH值至6.5)－乙腈(58 ∶42);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20μL。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.2 溶液制備

精密稱取紅霉素對(duì)照品40 mg，至10 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取本品20粒的內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于紅霉素100 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇2.5 mL使溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方比例，取除紅霉素外的其他組分制得陰性樣品，按供試品溶液方法制成陰性對(duì)照品溶液。取甲醇1 mL至10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，作為空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液和陰性對(duì)照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，溶劑及其他成分對(duì)紅霉素的測(cè)定無(wú)干擾，紅霉素峰的保留時(shí)間約為6 min，能達(dá)到基線分離，分離度符合要求，理論板數(shù)大于2 000。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5，10，15，20，25，30，35μL，注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測(cè)定紅霉素峰面積，以紅霉素進(jìn)樣量(X)為縱坐標(biāo)、峰面積(Y)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=2.93×104+1.33×105X，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，紅霉素質(zhì)量濃度在20～140 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密量取對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按擬訂的色譜條件測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD=0.35%(n=6)，表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為110101)6份，依法制備供試品溶液，并按擬訂的色譜條件測(cè)定。結(jié)果紅霉素的平均含量(標(biāo)示百分含量)為 101.37% ，結(jié)果的 RSD 為 0.68%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液 20 μL，分別于 0，2，4，6，8，10，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD=0.87%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的供試品6份(每份約相當(dāng)于紅霉素50 mg)至25 mL量瓶中，加甲醇2.5 mL使溶解，分別精密加入質(zhì)量濃度為 4 g/L 的對(duì)照品溶液 10.0，10.0，12.5，12.5，15.0，15.0 mL，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液按擬訂的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取5批樣品，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密量取20μL，按擬訂的色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微生物檢定法和HPLC法檢測(cè)結(jié)果比較(n=5)

2.5 微生物檢定法和HPLC法的比較

比較了5個(gè)批號(hào)樣品的微生物檢定法和HPLC法檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表2。兩者測(cè)得標(biāo)示量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明本法可替代微生物檢定法對(duì)紅霉素腸溶膠囊的含量進(jìn)行控制。

3 討論

在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇上，取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別按擬訂的色譜條件在安捷倫1260液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)上測(cè)定，記錄0～10 min，200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的等吸收?qǐng)D和3D圖，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品溶液和供試品溶液的光譜圖基本一致，紅霉素雖在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，但吸光強(qiáng)度較弱;而210 nm波長(zhǎng)雖不是最大吸收波長(zhǎng)，但該處吸光強(qiáng)度較高，輔料雜質(zhì)干擾較小。試用210 nm測(cè)定，取得了滿意的線性關(guān)系，且有較好的重現(xiàn)性和精密度。故選用該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

首先選擇乙腈－水為流動(dòng)相。因樣品的極性較大，選磷酸鹽作為流動(dòng)相成分之一，在進(jìn)行多次試驗(yàn)后，最終選用0.067 mol/L磷酸二氫銨溶液(用三乙胺調(diào)pH至6.5)－乙腈(58∶42)作為流動(dòng)相，可取得較好的峰形和分離度。

紅霉素的高效液相色譜法比微生物檢定法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為紅霉素腸溶膠囊的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:302.