姜昱竹，胡雪梅，邢建琴，王躍嗣，劉現(xiàn)兵，郭春鳳

(1濱州醫(yī)學院煙臺校區(qū)，山東煙臺264003;2威海市文登中心醫(yī)院)

原發(fā)性免疫缺陷病(PIDD)是由于免疫系統(tǒng)遺傳基因異?；蛳忍煨悦庖呦到y(tǒng)發(fā)育障礙而致免疫功能不全引起的罕見疾病，多發(fā)生于嬰幼兒。患兒除表現(xiàn)為免疫功能缺損外，尚可伴有其他組織器官的發(fā)育不全或畸形，可導(dǎo)致患兒夭折［1］。近年研究表明，PIDD多數(shù)具有明顯的遺傳傾向［2］。2011年3月，我們采用EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉(zhuǎn)化PIDD患者外周血B淋巴細胞建立B淋巴母細胞系(B lymphoblastoid cell line，B-LCL)，旨在為進一步開展PIDD的遺傳學和分子生物學研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 B95-8細胞株(本實驗室保存)，RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(HyClone公司)，環(huán)孢菌素 A(Cyclosporin A，CsA，Sigma公司)，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液(天津TBD生物技術(shù)有限公司)，PIDD患者外周血(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)。

1.2 實驗方法

1.2.1 EBV懸液的制備 將B95-8細胞密度調(diào)整為1×106/mL，接種于10 mL含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d半量換液1次，逐漸增加培養(yǎng)基到所需體積，之后不再更換和補充培養(yǎng)基，至培養(yǎng)物變?yōu)辄S色。收集細胞懸液于－70℃及37℃反復(fù)凍融3次，2 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，分裝后－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外周血單個核細胞(PBMCs)分離 無菌采集PIDD患者外周肝素抗凝血6 mL，PBS等量稀釋后沿管壁緩慢加于8 mL淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心15 min，小心吸出含有PBMCs的中間層將其轉(zhuǎn)移至另一離心管中，PBS洗滌2次，收集細胞備用。

1.2.3 EBV轉(zhuǎn)化B-LCL的建立 用3 mL含20%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基重懸上述PBMCs，加入EBV懸液1 mL，CsA 80μL(終質(zhì)量濃度為2μg/mL)，混勻后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d左右鏡下觀察，根據(jù)細胞轉(zhuǎn)化和增殖情況半量換液;待細胞較多聚團生長時傳代至T75培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)、換液和傳代;3～4周可獲得穩(wěn)定的B-LCL。

1.2.4 B-LCL的凍存與復(fù)蘇 預(yù)先配制細胞凍存液(95%胎牛血清+5%二甲基亞砜)，按每管5×106個細胞加入1.5 mL凍存液，放入預(yù)冷的梯度降溫細胞凍存盒中，－80℃過夜，次日移入液氮中長期保存。復(fù)蘇時將細胞凍存管迅速置于37℃水浴箱融化，離心去上清，以含20%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞后移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 B-LCL的核型檢測 取 PBMCs和轉(zhuǎn)化后細胞B-LCL分別加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)18～24 h，充分吹散細胞團，加秋水仙素37℃放置2 h，1 500 r/min離心10 min，棄上清;以KCl溶液(0.075 mol/L)8 mL重懸沉淀，37℃放置30 min;加入甲醇/冰醋酸1 mL，輕輕吹打混勻，離心棄上清;加入甲醇/冰醋酸10 mL輕輕重懸沉淀，室溫放置30 min，離心棄上清;重復(fù)甲醇/冰醋酸固定2次，離心后剩余1 mL液體重懸沉淀;常規(guī)法制片;晾干后Giemsa染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 B-LCL的形態(tài)學特征 接種后7 d左右倒置顯微鏡顯示，細胞形態(tài)呈淋巴母細胞樣改變，細胞體積明顯增大，呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富(圖1A);約2周開始形成肉眼可見、大小不等的白色細胞克隆(圖1B);之后隨細胞分裂增生，細胞數(shù)量不斷增多，細胞克隆不斷增大，呈懸浮或半貼壁生長(圖1C)，高倍鏡下可見細胞克隆邊緣有毛刺狀突起。

圖 1 EBV 轉(zhuǎn)化 7 d(A)、14 d(B)、21 d(C)B淋巴母細胞的形態(tài)(100×)

2.2 B-LCL的凍存、復(fù)蘇與擴增 細胞在液氮中保存4周后復(fù)蘇活性良好，臺盼藍染色顯示細胞活性＞90%。復(fù)蘇后3 d即可傳代，鏡下觀察細胞形態(tài)正常。建立的B-LCL細胞系可連續(xù)傳代培養(yǎng)4個月以上。

2.3 B-LCL的核型 PBMCs和轉(zhuǎn)化后細胞B-LCL染色體的核型分析未見異常。

3 討論

自1952年Bruton發(fā)現(xiàn)首例PIDD以來，迄今為止已發(fā)現(xiàn)160多種PIDD［3］。PIDD發(fā)病年齡早，臨床以感染為主要特征，可嚴重影響患兒的生活質(zhì)量，并造成高致殘率和高致死率［1］。盡管其病因尚未完全清楚，但目前已發(fā)現(xiàn)百余種與PIDD相關(guān)的基因異常［2］。外周血淋巴細胞是細胞遺傳學和分子遺傳學研究最常用的標本，然而其壽命有限，給進一步的研究工作帶來許多不便。EBV是一種普遍存在的人類皰疹病毒，在體外能夠高效率感染靜止的B淋巴細胞，使其成為連續(xù)分裂、永久生存的BLCL，是在體外獲得無限量B淋巴細胞及保存遺傳信息的有效手段［4］。EBV基因組可以500～800拷貝存在于宿主細胞中，對其基因組 DNA多無影響［5］。因此，永生化B-LCL可保存提供血樣個體的完整基因組，且其生化和分子生物學特性不發(fā)生變化［6］。此外，EBV在體外對B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化效率很高，一般能達到80% ～100%。近年來，國內(nèi)外實驗室普遍采用EBV感染外周血來建立人類遺傳種質(zhì)庫。目前為止，本實驗室共建成PIDD患者外周血永生化 B-LCL細胞株 16例，建株成功率為100%。

正常人群中約90%以上個體在兒童時期曾感染過EBV，其形成的抗EBV免疫功能可持續(xù)終身。體外建系時，EBV特異性的記憶T淋巴細胞接觸病毒后可被激活，對EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞產(chǎn)生特異的細胞毒作用［7］，使得形成的淋巴母細胞克隆很快退化;另外CD+4T淋巴細胞也可通過CD95和CD95配體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化B淋巴母細胞的凋亡［8］，使B淋巴細胞不能轉(zhuǎn)化或其轉(zhuǎn)化的增殖灶在1～2周迅速退化，致使建系失敗。因此，抑制或去除外周血中T淋巴細胞的活性是建立B-LCL的關(guān)鍵。CsA是一種高效免疫抑制劑，能夠在G0、G1期選擇性抑制T淋巴細胞RNA聚合酶Ⅱ的活性［9］，使T淋巴細胞失去對EBV的免疫反應(yīng)，從而有效防止已轉(zhuǎn)化的B淋巴母細胞退化，使B-LCL的建系和增殖得以成功。本實驗即采用EBV感染加CsA轉(zhuǎn)化的方法建系，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化后細胞的體積明顯增大，呈母細胞化，聚集成團，懸浮或半貼壁生長;能夠成功凍存、復(fù)蘇及傳代;且轉(zhuǎn)化后細胞的染色體核型與PBMCs比較無明顯差異。表明PIDD患者永生化的B-LCL成功建立，且轉(zhuǎn)化后細胞核型穩(wěn)定，保留了原有的遺傳標志。

綜上所述，本實驗成功建立了PIDD患者永生化的B-LCL，為進一步開展PIDD的病因?qū)W研究及診斷、治療奠定了基礎(chǔ)。

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