郭冬梅，李玉娟，李純璞，白觀臣，陳 晨，滕清良

(泰安市中心醫(yī)院，山東泰安271000)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種發(fā)生于B淋巴細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞病，好發(fā)于中老年人，發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要采用化療、放療、免疫及造血干細(xì)胞移植治療。近年來(lái)，新型藥物的應(yīng)用使MM患者生存期有所延長(zhǎng)，但仍有較多患者發(fā)生耐藥及復(fù)發(fā)［1，2］。新近研究表明，Notch1 信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及預(yù)后中具有重要作用。2010年1月～2011年10月，我們利用攜帶Notch1-ICN的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染MM細(xì)胞株RP MI8226，觀察外源性Notch1信號(hào)對(duì)對(duì)MM細(xì)胞株RPMI8226增殖、周期改變及藥物敏感性的影響，旨在探索Notch1通路在MM發(fā)生、發(fā)展及耐藥中的作用，尋找MM治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人 MM 細(xì)胞株 RPMI8226，Notch1-ICN病毒(由目的基因質(zhì)粒 pMSCV-ICN/GFP、包裝質(zhì)粒pKat和編碼水泡性口膜炎病毒G-糖蛋白的包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G包裝而成)及對(duì)照病毒(CON)由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院惠贈(zèng);CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖的試劑盒(上海凱基生物技術(shù)有限公司)，兔抗人Notch1單克隆抗體(Abcam公司)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI，美國(guó) BD 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及鑒定 ①細(xì)胞培養(yǎng)、處理:取人MM細(xì)胞株RPMI8226置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首日按照每孔2×105/mL鋪24孔板，同時(shí)加入0.5 mL病毒上清及Polybrene(8μg/mL)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液過(guò)夜;第2、3天，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，重復(fù)第1天步驟。采用限制性稀釋方法獲得單個(gè)細(xì)胞，篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞。獲取RPMI8226-ICN及RPMI8226-CON細(xì)胞(分別為病毒組及病毒對(duì)照組)，同時(shí)設(shè)未經(jīng)感染的細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染組。②鑒定:選取上述三組細(xì)胞，裂解后收集蛋白樣品，采用Western blot法檢測(cè)Notch1-ICN蛋白表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 按每孔5×103個(gè)細(xì)胞將上述三組細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置CO2孵箱培養(yǎng)4 d，其后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明操作，每孔加入10 μL的 CCK-8液，分別于24、48、72、96 h后在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 藥物敏感性檢測(cè) 選取1.2.1中三組細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，分別將濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L 的硼替佐米加入培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)48 h后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明操作，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。根據(jù)公式(1－用藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%計(jì)算細(xì)胞抑制率。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 選取1.2.1中三組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL;1 000 r/min離心10 min;用75%冰乙醇懸浮，4℃過(guò)夜固定;次日PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，去除乙醇;分別加入500 L含有RNaseA的PI溶液，4℃避光30 min;用流式細(xì)胞儀測(cè)定單個(gè)細(xì)胞核中PI-DNA含量，用摻入的PI熒光強(qiáng)度反映單個(gè)細(xì)胞核中DNA含量，測(cè)定細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定 病毒組細(xì)胞Notch1-ICN蛋白表達(dá)水平約為病毒對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組的2.5倍，見(jiàn)圖1。

圖1 三組RPMI8226細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)

2.2 細(xì)胞增殖情況和對(duì)硼替佐米藥物的敏感性培養(yǎng)后48、72、96 h病毒組細(xì)胞增殖率均顯著高于病毒對(duì)照組(P均＜0.01)，見(jiàn)圖2;隨硼替佐米濃度增高，各組細(xì)胞抑制作用均逐漸增加，且同濃度條件下病毒組抑制率顯著低于病毒對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組，見(jiàn)表1。

圖2 病毒組和病毒對(duì)照組細(xì)胞增殖曲線

表1 不同濃度硼替佐米作用下三組細(xì)胞增殖抑制率(n=3，%，ˉx ±s)

2.3 細(xì)胞周期 病毒組S期細(xì)胞比例明顯高于其余兩組(P 均 ＜0.01)，見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 三組細(xì)胞周期比例

研究顯示，造血系統(tǒng)的多種惡性疾病如白血病、淋巴瘤和MM中均存在Notch活化。Notch信號(hào)異常與多種腫瘤的發(fā)病、細(xì)胞周期阻滯和治療預(yù)后有關(guān)。新近研究顯示，Notch信號(hào)在不同腫瘤組織及腫瘤發(fā)展的不同階段均可發(fā)揮促癌或抑癌作用。Xu等［3］研究顯示，激活Notch信號(hào)可加快MM病情進(jìn)展。Nefedova等的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Notchl-ICN可上調(diào)S期RPMI8226細(xì)胞比例，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。賈向旭等［5］發(fā)現(xiàn)，病毒感染細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)Notch1-ICN表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。Nefedova等［6］研究顯示，阻斷Notch1通路可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡增加，并可增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

為研究Notch信號(hào)通路在MM發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒體系轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其特點(diǎn)為高效地將目的基因整合到染色體上穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果顯示，應(yīng)用Notch1-ICN感染MM細(xì)胞后病毒組Notch1-ICN表達(dá)明顯上調(diào)，約為病毒對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組的2.5倍;培養(yǎng)后48、72、96 h病毒組細(xì)胞增殖率均顯著高于病毒對(duì)照組。提示上調(diào)Notchl表達(dá)可促進(jìn)RPMI8226細(xì)胞增殖。以硼替佐米為代表的新型靶向藥物的出現(xiàn)使MM患者的緩解率和總生存率顯著改善，但大部分患者仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥。為研究Notch1表達(dá)上調(diào)對(duì)藥物敏感性的影響，本研究選擇硼替佐米用于實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨硼替佐米濃度增高，各組細(xì)胞抑制作用均逐漸增加，且同濃度條件下病毒組抑制率顯著低于病毒對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組。說(shuō)明Notch1通路活化可使RPMI8226細(xì)胞對(duì)硼替佐米敏感性降低。此外，本研究還顯示病毒組S期細(xì)胞比例明顯高于其余兩組。提示外源性Notchl活化可通過(guò)增加S期細(xì)胞比例促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，還可降低MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性。

綜上所述，Notch1信號(hào)通路活化與MM的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，有望成為MM治療的新靶點(diǎn)。

［1］Piro E，Kropp M，Cantaffa R，et al.Visceral leishmaniasis infection in a refractory multiple myeloma patient treated with bortezomib［J］.Ann Hematol，2012 May 15.［Epub ahead of print］

［2］Kumar SK，Lee JH，Lahuerta JJ，et al.Risk of progression and survival in multiple myeloma relapsing after therapy with IMiDs and bortezomib:A multicenter international myeloma working group study［J］.Leukemia，2012，26(5):1153.

［3］Xu D，Hu J，Xu S，et al.Dll1/Notch activation accelerates multiple myeloma disease development by promotingMM-cell proliferation［J］.Leukemia，2011，Nov 18.doi:10.1038/leu.2011.332.［Epub ahead of print］

［4］Nefedova Y，Sullivan DM，Bolick SC，et al.Inhibition of Notch signaling induces apoptosis of myeloma cells and enhances sensitivity to chemotherapy［J］.Blood，2008，111(4):2220-2229.

［5］賈向旭，魯茁壯，王華，等.激活Notch信號(hào)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2004，12(3):335-339.