楊歡歡，胡中澤*

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

紅曲菌的復(fù)合誘變及其固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

楊歡歡，胡中澤*

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

通過(guò)紫外線和LiCl對(duì)一株紅曲菌MP進(jìn)行復(fù)合誘變，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)其固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果表明：在前期溫度為30℃，后期溫度為24℃，初始含水量為60%的條件下，Monacolin K的產(chǎn)量最高可達(dá)5.33mg/g。

紅曲菌；復(fù)合誘變；Monacolin K；響應(yīng)面

紅曲起源于中國(guó)，其在食品方面的應(yīng)用已很廣泛。目前，隨著對(duì)紅曲研究的深入，紅曲在醫(yī)藥保健方面的用途也越來(lái)越受關(guān)注，其中功能性紅曲在此方面的價(jià)值更為突出。功能性紅曲是指可降膽固醇、治療高血脂的紅曲[1-2]。

紅曲菌的主要功能性產(chǎn)物之一——Monacolin K是日本遠(yuǎn)藤章利用小型發(fā)酵罐深層發(fā)酵培養(yǎng)紅曲菌得到的。Monacolin K抑制膽固醇形成的機(jī)理是Monacolin K能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA) 還原酶(HMG-R)，進(jìn)而抑制了膽固醇的合成，其中HMGCoA還原酶是膽固醇合成中的限速酶[3]。Monacolin K還能增加膽固醇的分解代謝，降低甘油三酯及低密度脂蛋白(LDL)[4]。由于此種特性，如何提高紅曲菌中Monacolin K的產(chǎn)量成為研究重點(diǎn)。

目前紅曲生產(chǎn)中廣泛采用的是固態(tài)發(fā)酵法，其具有投資少，產(chǎn)量大，生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)豐富等優(yōu)點(diǎn)[5]。生產(chǎn)Monacolin K一般也利用紅曲菌固體發(fā)酵法，但在工業(yè)化固體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)條件對(duì)其產(chǎn)量的影響很大，因此合理設(shè)計(jì)固態(tài)發(fā)酵工藝條件是達(dá)到高產(chǎn)Monacolin K目的的關(guān)鍵步驟[6]。

本實(shí)驗(yàn)利用理化復(fù)合誘變方法提高紅曲菌產(chǎn)Monacolin K的能力，并通過(guò)響應(yīng)面分析法研究固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中各工藝條件對(duì)紅曲生產(chǎn)Monacolin K的影響，最終得到固態(tài)發(fā)酵條件的最優(yōu)組合。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

紅曲菌MP 本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麥芽汁10°Bx，瓊脂2%。用作斜面和平板培養(yǎng)。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：適量發(fā)芽糙米洗凈浸泡后于250mL錐形瓶中蒸煮，滅菌20min。

1.2 試劑與儀器

無(wú)水乙醇、磷酸(分析級(jí))、乙腈(色譜級(jí))、洛伐他汀對(duì)照品。

PHS-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；YM50型不銹鋼立式蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；YM50型不銹鋼立式高壓蒸汽滅菌箱 上海三申醫(yī)療器械有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株誘變的處理方法

在紅曲菌的培養(yǎng)過(guò)程中，Monacolin K是次級(jí)代謝產(chǎn)物，代謝機(jī)制復(fù)雜，其產(chǎn)量是由多基因決定的，誘變后產(chǎn)量提高是多基因效應(yīng)的結(jié)果[7]。本實(shí)驗(yàn)采用LiCl作為化學(xué)因子和UV作為物理因子對(duì)紅曲菌MP進(jìn)行復(fù)合誘變處理。

具體操作步驟：量取6mL孢子懸液于無(wú)菌平皿中，在距離紫外燈30cm處打開(kāi)皿蓋開(kāi)始照射。將照射后的菌懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管中，并立即浸入冰水中暗室保存3h。按10倍稀釋法將經(jīng)UV處理過(guò)的孢子懸液依次稀釋?zhuān)⒏魑?.1mL涂布在含有0.8g/L LiCl溶液的平板上，放入暗室中34℃培養(yǎng)6d，以備分離篩選[7]。

1.3.2 誘變篩選

在對(duì)菌種進(jìn)行誘變時(shí)，只有每次誘變后有1～2個(gè)控制產(chǎn)量的基因突變，使產(chǎn)量合成稍有增加且又能維持其最起碼代謝平衡的菌株才能生存下來(lái)，因此，高產(chǎn)菌株的產(chǎn)量提高，是通過(guò)多代誘發(fā)突變逐漸積累的結(jié)果[8]。

采用傳統(tǒng)選育中常用的方法，挑選的菌落直接接入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

第一代：紅曲菌MP→制備孢子懸液→UV照射→分離到含有LiCl的MEA平板上→挑選200個(gè)菌落→初篩50株→復(fù)篩4株[8]。第二代：出發(fā)菌株4株→制備孢子懸液→UV照射→分離到含有LiCl的MEA平板上→挑選200個(gè)菌落→初篩50株→復(fù)篩4株。第三、四代與以上操作方法相同。

初篩：選擇生長(zhǎng)速度減緩和形態(tài)發(fā)生明顯變異的菌落。

復(fù)篩：對(duì)初篩出的50株紅曲菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)14d，采用HPLC法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的Monacolin K進(jìn)行定量檢測(cè)，篩選出產(chǎn)量高的菌株[9-10]。

1.3.3 HPLC法定量檢測(cè)

樣品處理：將發(fā)酵后的紅曲米于60℃烘干至質(zhì)量恒定，研磨過(guò)100目篩。取適量樣品溶于5mL流動(dòng)相中，并超聲助溶30min，40℃水浴1h，5000r/min離心15min，取上清液過(guò)0.45μm濾膜待用。

色譜柱：Welchrom-C18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；流動(dòng)相：乙腈-磷酸水溶液；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析法

在紅曲菌固態(tài)發(fā)酵萌芽米過(guò)程中采用變溫培養(yǎng)，以前期培養(yǎng)溫度、后期培養(yǎng)溫度以及初始含水量為3個(gè)主要影響因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變

2.1.1 紫外線復(fù)合0.8g/L LiCl誘變對(duì)菌株的影響

選擇紫外線照射時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90、105、120s，將孢子懸液涂布在含LiCl質(zhì)量濃度為0.8g/L的MEA平板上，觀察紅曲菌的生長(zhǎng)情況。

圖1 紫外線照射時(shí)間對(duì)紅曲孢子的致死作用Fig.1 Lethal effect of UV light on Monascus purpureu

由圖1可知，孢子的致死率隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)照射時(shí)間為120s時(shí)，孢子的致死率近100%。而照射時(shí)間90s時(shí)致死率為90%左右，將此時(shí)間作為復(fù)合誘變處理的紫外照射時(shí)間。

2.1.2 復(fù)合誘變篩選出菌種的發(fā)酵產(chǎn)量

圖2 突變菌株和出發(fā)菌株M-H2的比較Fig.2 Comparative monacolin K yield of original strain M-H2 and its mutant strains

對(duì)紅曲菌MP進(jìn)行上述復(fù)合誘變，誘變條件為紫外照射時(shí)間90s，LiCl質(zhì)量濃度為0.8g/L。MP經(jīng)誘變后得到80多株突變株，挑取菌落形態(tài)發(fā)生明顯變異的30株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)14d，采用HPLC法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的Monacolin K進(jìn)行定量檢測(cè)。按1.3.2節(jié)的篩選步驟和方法，連續(xù)誘變4代后得到以下突變株，結(jié)果如圖2所示。15株菌株為第一、二、三代突變株中Monacolin K產(chǎn)量較高菌株，而第四代誘變時(shí)，相同條件下致死率下降，產(chǎn)Monacolin K能力無(wú)明顯變化。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，并與誘變前進(jìn)行比較得到目的菌株M-H4-3，其Monacolin K的產(chǎn)量為4.02mg/g，而相同發(fā)酵條件下出發(fā)菌株M-H2的Monacolin K的產(chǎn)量?jī)H為2.35mg/g。

2.1.3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)目的菌株M-H4-3進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將其接種在麥芽汁培養(yǎng)基上連續(xù)傳代至第五代，每代均接種到萌芽米上進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。利用HPLC法對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。菌株M-H4-3在固態(tài)發(fā)酵萌芽米過(guò)程中對(duì)Monacolin K有較高的產(chǎn)量，且性能穩(wěn)定。

圖3 突變株M-H4-3遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Genetic stability of mutant strain M-H4-3

2.2 前期溫度對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

圖4 前期溫度對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of initial temperature on monacolin K yield

Monacolin K是紅曲發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而次級(jí)代謝的一個(gè)重要特征是其代謝產(chǎn)物一般只在菌絲體的生長(zhǎng)速率降低時(shí)才合成[11]，因此Monacolin K的形成應(yīng)滯后于菌絲體的生長(zhǎng)，而紅曲菌絲體的良好生長(zhǎng)是高產(chǎn)Monacolin K的重要基礎(chǔ)[12]。采用變溫培養(yǎng)，在其他條件不變的情況下，首先固定后期溫度為25℃，研究前期發(fā)酵溫度對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。30℃時(shí)Monacolin K產(chǎn)量最高，之后Monacolin K產(chǎn)量隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度升至38℃時(shí)幾乎沒(méi)有產(chǎn)量，說(shuō)明此溫度紅曲菌菌絲體幾乎不生長(zhǎng)。

2.3 后期溫度對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

在紅曲米發(fā)酵過(guò)程中后期溫度直接影響Monacolin K在菌絲體生長(zhǎng)中的代謝積累[13]，因此，固定前期溫度30℃，后期溫度分別設(shè)為20、24、28、32℃培養(yǎng)紅曲米，研究后期溫度對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 后期溫度對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of late temperature on monacolin K yield

由圖5可知，后期溫度為24℃時(shí)Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到最大，而當(dāng)溫度高于24℃時(shí)Monacolin K的產(chǎn)量驟降，當(dāng)后期溫度高于前期溫度時(shí)紅曲生長(zhǎng)緩慢幾乎不代謝Monacolin K。

2.4 初始含水量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

圖6 初始含水量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of original moisture content on monacolin K yield

在固態(tài)發(fā)酵時(shí)，孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)都需要適宜的水分，而固態(tài)發(fā)酵最大的特點(diǎn)就是無(wú)游離水[14]，因此底物含水量的變化對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝能力會(huì)產(chǎn)生重要的影響[15]。在其他條件不變的情況下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究初始含水量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。在初始含水量60%時(shí)Monacolin K累積量達(dá)到最大值，通過(guò)觀察各水平紅曲米的發(fā)酵生長(zhǎng)情況得知潮濕的環(huán)境比較適合紅曲菌的生長(zhǎng)。

2.5 固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析結(jié)果

以Monacolin K的產(chǎn)量為響應(yīng)值(Y)，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)并進(jìn)行試驗(yàn)，得到紅曲菌固態(tài)發(fā)酵萌芽米的最優(yōu)組合條件。結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析見(jiàn)表3。根據(jù)回歸方程，采用軟件繪制響應(yīng)面和等值線圖，考察響應(yīng)曲面情況，見(jiàn)圖7。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得回歸方程：

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression equations

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)并等于零，得到有3個(gè)方程組成的方程組，解答該方程組得到：X1＝30.53，X2＝25.68，X3＝60.07。即應(yīng)用數(shù)學(xué)模型得出的理論最優(yōu)培養(yǎng)條件：前期溫度為30.53℃，后期溫度為25.68℃，初始含水量為60.07%，Y的最大值為5.92mg/g。而第4組試驗(yàn)的產(chǎn)量最高，即在前期溫度為30℃、后期溫度為24℃、初始含水量為60%的條件下，Monacolin K產(chǎn)量是5.69mg/g。因此可以看出理論最優(yōu)點(diǎn)在此附近。

由表3可知，一次項(xiàng)以及二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均很顯著，交互項(xiàng)則不顯著。在此模型中失擬項(xiàng)不顯著，回歸高度顯著，可以用此模型進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測(cè)。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2＝0.9981，說(shuō)明回歸方程的擬合程度良好，可以用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。

圖7 前期溫度、后期溫度和初始含水量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等值線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of initial temperature, late temperature and original moisture content on monacolin K yield

2.6 擬合優(yōu)化的驗(yàn)證

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，通過(guò)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出的理論最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證，即在前期溫度為30℃、后期溫度為24℃、初始含水量為60%的條件下，用目的菌株M-H4-3固態(tài)發(fā)酵萌芽米，進(jìn)行5次固態(tài)發(fā)酵所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值為5.33mg/g，與理論值的相對(duì)誤差為0.91%。

3 結(jié) 論

3.1 以LiCl作為化學(xué)因子和UV作為物理因子對(duì)紅曲菌MP進(jìn)行復(fù)合誘變處理，通過(guò)反復(fù)誘變和篩選得到一株Monacolin K產(chǎn)量較高的菌株M-H4-3，其產(chǎn)量為4.02mg/g，與作為對(duì)照的出發(fā)菌株(2.35mg/g)相比，其產(chǎn)量提高1.7倍。

3.2 通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)紅曲菌固態(tài)發(fā)酵萌芽米條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立紅曲菌固態(tài)發(fā)酵萌芽米過(guò)程中Monacolin K代謝積累的回歸模型，分析各因素效應(yīng)的顯著性以及兩兩因素間的交互作用。在前期溫度為30℃、后期溫度為24℃、初始含水量為60%的條件下，Monacolin K產(chǎn)量提高至5.33mg/g。

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Combined Mutation of Monascus and Optimization of Fermentation Conditions for Monacolin K Production

YANG Huan-huan，HU Zhong-ze*
(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

A strain of Monascus purpureu was treated with UV irradiation and its spore was then incubated in media containing LiCl to induce mutation. A mutant strain with high yield of monacolin K was obtained and its fermentation conditions were optimized for monacolin K production. The results showed that the optimal fermentation conditions were initial temperature of 30 ℃, late temperature of 24 ℃ and original moisture content of germinated brown rice of 60%. Under these conditions, the yield of monacolin K reached 5.33 mg/g.

Monascus；combined mutation；monacolin K；response surface methodology

Q939.99

A

1002-6630(2012)11-0247-05

2011-05-18

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2009CDA099)

楊歡歡(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：yanghuanhuan022@126.com

*通信作者：胡中澤(1968—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)榧Z油工程。E-mail：hzz1968@126.com