郭彩華，林 麗，陳昭華，盧珍華，孫莉萍，余 菁

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門夏商淘化大同調味品有限公司，福建 廈門 361000)

黑醬油類黑素的提取、光譜性質及功能

郭彩華1，林 麗1，陳昭華1，盧珍華1，孫莉萍2，余 菁1

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門夏商淘化大同調味品有限公司，福建 廈門 361000)

從黑醬油中提取類黑素并對其光譜性質和功能進行研究。結果表明：經(jīng)有機溶劑沉淀及脫鹽處理，冷凍干燥獲得類黑素粗制品，得率為22.8g/100mL；經(jīng)Sephadex G-50凝膠層析除去小分子物質，得到分子質量分布在3000～55000u的類黑素純品。紫外和紅外光譜掃描結果顯示類黑素粗品是美拉德反應和酶促褐變的產(chǎn)物。類黑素粗制品對DPPH自由基的清除率最高達89.0%，對羥自由基的清除能力達89.5%，對亞硝胺合成的抑制率可達80.0%。提示醬油類黑素粗制品可以作為功能性固體醬油被開發(fā)，類黑色素純品可開發(fā)成為功能性食用色素。關鍵詞：黑醬油；類黑素；DPPH自由基；羥自由基

醬油是一種富含多種氨基酸和風味物質，具有特殊色香味的調味品。關于醬油健康功效的研究國內外都有報道，主要是抗癌、抗氧化、預防心血管疾病等。Benjamin等[1]發(fā)現(xiàn)醬油對苯并芘誘導的小鼠賁門竇瘤形成有抑制作用。Kataoka[2]報道醬油能降低小鼠肝腫瘤的發(fā)生率，醬油中含有的血管緊縮素Ⅰ轉換酶抑制劑，具有抗高血壓的功能。新加坡國立大學生物化學系研究人員發(fā)現(xiàn)，黑醬油在人體內產(chǎn)生的抗氧化作用，比紅酒還高，有助于防止自由基對血管造成的破壞，降低動脈硬化引發(fā)心臟病或中風的危險[3]。先宏等[4]通過自旋捕集和電子順磁共振技術研究了3種品牌醬油對活性氧類自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)清除效果顯著。

醬油的化學組分十分復雜，從現(xiàn)有的資料看，醬油的功效物質主要是色深物質，或稱為類黑素的物質[5-7]，但是到目前為止國內對醬油類黑素的提取分離應用研究工作報道極少。本實驗以黑醬油為原料，沉淀法提取類黑素并進行純化，對類黑素性質進行研究，進而為醬油類黑素的應用提供可參考的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑醬油由廈門夏商淘化大同調味品有限公司提供。按SB/T 10313—1999《固稀發(fā)酵法醬油釀造工藝規(guī)程》釀造。以豆粕、小麥為主要原料，經(jīng)過前期固態(tài)發(fā)酵后期稀發(fā)酵，成熟醬醪壓濾分離，日曬夜露3個月后的生醬油。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、細胞色素C、牛血清白蛋白、卵清蛋白、氨基酸標準溶液 美國Sigma公司；Sephedex G-50、藍色葡聚糖2000 美國Pharmacia公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

L-8900氨基酸分析儀 日本日立公司；FT/IR-400/600傅里葉變換紅外光譜儀 Jasco日本分光公司；冷凍干燥機 美國Thermo公司；CARY50紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；Milli-Qcentury超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 類黑素的沉淀提取工藝

提取工藝關鍵點的說明：常溫下將醬油和無水乙醇以體積比1:1.75混勻，靜置24h。上層清液和丙酮以體積比1:1處理。加水溶解，沉淀物與水以1:2(m/V)處理，目的是脫鹽。

1.3.2 Sephadex G-50分子篩柱層析法純化類黑素

根據(jù)文獻[8-9]的報道，黑色素的質量濃度與400nm 波長處的吸光度成線性關系，因此，實驗中配制不同質量濃度的類黑素溶液，測定其在400nm波長處的吸光度。結果發(fā)現(xiàn)，在質量濃度為0～10.0g/L范圍內，醬油類黑素溶液質量濃度(x，g/L)與吸光度(y)之間呈良好的線性相關關系，y= 0.1637x＋0.028 (R2＝ 0.9995)。由此實驗中類黑素含量的變化以400nm波長處測定的吸光度表示。

將1g類黑素粗制品溶于5mL超純水。過Sephadex G-50柱(1.0cm×30cm)，上樣量0.5mL，用超純水進行洗脫，流速 2mL/min，自動部分收集儀收集洗脫液，每管收集1mL，在400nm波長處測吸光度。重復10次，合并相同編號的洗脫液冷凍干燥，得到純化的類黑素。

1.3.3 類黑素分子質量分布的測定

采用分子排阻色譜法測定類黑素分子質量分布[10-11]，分別將已知相對分子質量的藍色葡聚糖2000(2000000u)、細胞色素C(13000u)、牛血清白蛋白(67000u)、卵清蛋白(43000u)溶解于超純水中，質量濃度為4.0g/L。上Sephadex G-50凝膠柱(1.0cm ×30cm)，以超純水洗脫，上樣量0.5mL，流速 0.5mL/min，自動部分收集儀收集洗脫液，根據(jù)顏色和280nm波長的吸光度，計算各自的洗脫體積。藍色葡聚糖2000的洗脫體積記作Vo，細胞色素C、牛血清白蛋白、卵清蛋白的洗脫體積記作Vo，繪制分子質量標準曲線。根據(jù)類黑素溶液的洗脫體積，確定類黑素分子質量的分布。

1.3.4 類黑素的成分測定

1.3.4.1 基本成分

總氮測定：采用凱氏定氮法[12]；總糖含量測定：采用直接滴定法[12]；氯化鈉含量測定：采用G B/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》測定。

1.3.4.2 氨基酸測定

采用氨基酸自動分析儀法[12]，試樣經(jīng)LC-18柱(Supelclean LC-18 SPE小柱，型號規(guī)格500mg/3mL)過濾至無色，取濾液20μL于L-8900氨基酸分析儀自動連續(xù)進樣器進行氨基酸測定。采用外標法定量。

1.3.5 類黑素的光譜性質研究

類黑素粗制品配制成不同質量濃度的水溶液，用CARY50 紫外-可見分光光度計，在室溫條件下以超純水做基線校正，分別于200～1000nm和200～450nm波長范圍內進行光譜掃描。類黑素粗制品3mg用300mg KBr壓片后做紅外光譜掃描，范圍為4000～400cm-1。

1.3.6 類黑素的功能研究

1.3.6.1 類黑素對DPPH自由基的清除活性測定

參照文獻[13]的方法做一定的修改后進行。精確移取2.00mL待測的類黑素粗制品溶液于 10mL試管中，加入2.00mL 0.16mmol/L DPPH 95%乙醇溶液，使總體積為4.00mL，搖勻，室溫放置30min后，記錄517nm吸光度為Ai。以VC作陽性對照，測IC50(自由基清除率達50%時的清除劑質量濃度)。根據(jù)公式(1)計算樣品清除率。

式中：Ai是2mL DPPH溶液和2mL待測溶液的吸光度；Aj是2 mL待測溶液和2mL 95%乙醇的吸光度；A0是2mL DPPH溶液和2mL水的吸光度。

1.3.5.2 類黑素對羥自由基清除能力的測定

羥自由基的產(chǎn)生和測定按文獻[14]所描述的方法進行。以不加H2O2溶液的作為參比溶液，于510nm波長處測定的吸光度為Ao。類黑素羥自由基清除能力的測定是在羥自由基的產(chǎn)生的基礎上分別加入不同質量濃度的類黑素粗制品溶液1mL，然后再進行測定，于510nm波長處的吸光度記作AS(參比實驗不加H2O2溶液)。根據(jù)公式(2)計算樣品清楚率。

1.3.5.3 類黑素對亞硝胺合成的抑制實驗

取20個25mL容量瓶，分為兩組(每組10個)，吸取不同量的類黑素粗制品溶液，加入pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液10mL，其中一組加入1mmol/L的NaNO2溶液1.0mL，1mmol/L的二甲胺溶液1.0mL，另一組不加作為參比溶液，用超純水稀釋至刻度，在37℃條件下恒溫1h。然后按文獻[15]所描述的紫外光解法操作，在525nm波長處測吸光度AX。同時以超純水替代類黑素溶液做空白實驗測Ao。根據(jù)公式(3)計算樣品的抑制率。

2 結果與分析

2.1 醬油類黑素的提取純化結果

2.1.1 醬油及類黑素粗制品的基本營養(yǎng)成分比較

取100mL黑醬油經(jīng)乙醇、丙酮沉淀，經(jīng)加水脫鹽處理及冷凍干燥后，可得(22.8±2.02)g類黑素粗制品，其為棕褐色帶有濃郁醬香味的固形物。醬油及類黑素粗制品的基本營養(yǎng)成分比較見表1。

表1 醬油及類黑素粗制品的基本營養(yǎng)成分比較(±s，n=3)Table 1 Basic nutritional components in soy sauce and crude melanoidin (±s，n=3)

表1 醬油及類黑素粗制品的基本營養(yǎng)成分比較(±s，n=3)Table 1 Basic nutritional components in soy sauce and crude melanoidin (±s，n=3)

樣品 全氮/g 總糖/g 氯化鈉/g醬油(100mL) 2.321±0.034 8.462±0.205 20.12±0.105類黑素粗制品(100g) 4.732±0.038 12.041±0.186 11.56±0.068

2.1.2 醬油及類黑素粗制品的氨基酸組成及必需氨基酸含量比較

經(jīng)L-8900氨基酸分析儀分析，醬油和類黑素粗制品中都測出含有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸等17種氨基酸，經(jīng)外標法確定醬油的總氨基酸含量4.08g/100mL；類黑素粗制品的總氨基酸含量為10.98g/100g干品。醬油及類黑素粗品的必需氨基酸(EAA)含量比較見表2。

表2 醬油及類黑素粗制品的必需氨基酸含量比較Table 2 Essential amino acids in soy sauce and crude melanoiding

2.1.3 Sephadex G-50柱層析的洗脫結果及洗脫物的分子質量分布

Sephadex G-50柱層析法即凝膠過濾法，目的是除去小分子物質，這里主要是氨基酸和氯化鈉。由圖1可知，A400nm從低到高，在第18號管時達到最大為1.930，之后A400nm下降，至第27號管時A400nm是0.140。1g 類黑素粗制品經(jīng)Sephadex G-50分子篩層析純化并冷凍干燥后可獲得(877.6±4.1)mg 純品，得率為87.76%。

圖1 類黑素粗制品Sephadex G-50層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude melanoidin on Sephadex G-50 column

圖2 類黑素粗制品的相對分子質量標準曲線Fig.2 Standard curve of relative molecular weights

在分子排阻色譜法實驗中，以類黑素相對分子質量的對數(shù)(lgMr)為橫坐標，Ve/Vo為縱坐標，繪制的相對分子質量標準曲線為y＝－1.5736x＋8.7115(R2＝0.9952)。可知，醬油類黑素分子質量主要分布在3000～55000u之間。各類黑素樣品的顏色特點為：11、12、21～27號管樣品為淺棕色，13、14、20號樣品為棕色，15～19號管樣品顏色最深，為棕褐色；第11～20號管樣品有光澤，第21～27號管樣品無光澤。

2.2 醬油類黑素的光譜性質

圖3 不同質量濃度類黑素粗制品在200～1000nm的吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectrum of crude melanoidin at 200 to 1000 nm

由圖3可知，類黑素質量濃度不同，光譜圖有一定的差異，總的趨勢是在紫外波長處有吸收，最大吸收峰在215nm波長處，與Bell等[16]報道的類黑精紫外吸收特征一致。類黑素的質量濃度大于2mg/mL時，在近紫外區(qū)有多個吸收峰(圖3、4)?？梢酝茰y類黑素含有美拉德反應高級階段產(chǎn)生的大量活性小分子物質，如酮類和醛類衍生物[17]。

圖4 10mg/mL類黑素粗制品在200～450nm的吸收光譜Fig.4 UV-Vis spectrum of crude melanoidin at 200 to 450 nm

圖5 類黑素粗制品的紅外吸收光圖譜Fig.5 Infrared spectrum of crude melanoidin from soy sauce

由圖5可知， 3408cm-1寬而強的吸收峰是由分子間多聚締合的O－H和N－H伸縮振動產(chǎn)生的；在2974cm-1附近的弱吸收峰是C－H伸縮振動產(chǎn)生的；1625cm-1是由C＝O變形振動伯酰胺、C＝C共軛伸縮振動、芳環(huán)上C＝C骨架伸縮振動等產(chǎn)生；1384cm-1是由脂肪族和脂環(huán)族中－CH和－CH3對稱變形振動產(chǎn)生；1085cm-1是由C－O伸縮振動、脂肪C－O－C不對稱伸縮振動等產(chǎn)生。3400cm-1和 1630cm-1附近強吸收是吲哚基團[18]。醬油類黑素粗制品的紅外光譜圖與天然黑色素[19]的很相似，天然黑色素主要來自酶促褐變。紫外和紅外光譜特征說明了發(fā)酵醬油中的色素來自生產(chǎn)過程中的美拉德反應和酶促褐變。

2.3 醬類黑素的功能研究結果

2.3.1 醬油類黑素粗制品對DPPH自由基的清除能力由圖6可知，隨著樣品質量濃度的增加，醬油類黑素粗制品對DPPH自由基的清除能力增強，當類黑素質量濃度到達一定值之后，清除率不再增加，清除率最高達89%。類黑素粗制品的IC50為(4.876 ±0.205)g/L，而VC質量濃度為(4.831±0.097)g/L時的清除率為97.5%，可見類黑素粗制品對DPPH自由基的清除能力相當于VC的一半。

圖6 類黑素粗制品對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging efficiency of crude melanoidin from soy sauce on DPPH free radical

表3所示的是醬油類黑素純品(類黑素的質量濃度為5g/L)對DPPH自由基有清除能力?？梢娗宄芰εc類黑素的分子質量及色澤有一定的關聯(lián)度，分子質量6100～26500u且呈棕褐色的類黑素樣品清除率高，15～23號管樣品的平均清除率為90.04%，可見其比類黑素粗制品的清除率高。

2.3.2 醬油類黑素粗制品清除羥自由基的能力

圖7 類黑素粗制品對羥自由基的清除率Fig.7 Scavenging efficiency of crude melanoidin from soy sauce on hydroxyl free radical

由圖7可知，類黑素粗制品對羥自由基的清除能力隨著類黑素質量濃度的增大而逐漸增大，在質量濃度為1.0～6.0g/L范圍內，類黑素粗制品質量濃度與清除率之間呈良好的線性相關關系，y＝15.429x＋0.6667 (R2＝0.9772)。這種線性量效關系與文獻報道的相一致[7,20]，獲得的清除率達89.5%。

表3 不同分子質量范圍醬油類黑素純品對DPPH自由基的清除作用Table 3 Scavenging efficiency of different molecular weight fractions of purified melanoidin from soy sauce on DPPH free radical

2.3.3 醬油類黑素粗制品抑制亞硝胺合成的能力

亞硝胺可引起人和動物的胃、肝臟等多種器官的惡性慢性腫瘤，阻斷或減少亞硝胺的生成是預防腫瘤發(fā)生的一個重要措施。二甲胺與NaNO2在模擬人體胃液的條件(pH 3.0，37℃)下，可生成二甲基亞硝胺(NDMA)。實驗中先加入類黑素溶液，再依次加入亞硝酸鈉與二甲胺時，類黑素優(yōu)先同亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應，以達到阻止亞硝胺生成的目的。

圖8 類黑素粗制品對亞硝胺合成的抑制作用Fig.8 Inhibition of nitrosamine synthesis by crude melanoidin from soy sauce

由圖8可知，類黑素粗制品加入量在1.08g/L之前，隨著加入量的增加，類黑素對亞硝胺合成的抑制率逐漸增大，說明在模擬人體胃液的條件下，類黑素可有效地阻斷亞硝胺的合成。但當加入量超過1.08g/L時，其對亞硝胺合成的抑制率開始在80%～84%之間波動，這可能是由于醬油類黑素中含有黃酮類物質[7]，而黃酮質量濃度過高時，容易發(fā)生自身氧化聚合，而導致活性降低。綜合來說，類黑素抑制亞硝胺合成的抑制率可達80%。

3 結 論

黑醬油通過有機溶劑沉淀及脫鹽處理，冷凍干燥獲得類黑素粗制品，得率為22.8g/100mL，類黑素粗制品的總氨基酸含量為10.98g/100g干品。利用Sephadex G-50分子篩柱層析法純化類黑素，純化得率為87.76%。紫外和紅外光譜掃描結果顯示類黑素是美拉德反應和酶促褐變的產(chǎn)物。類黑素粗制品對DPPH自由基的清除率最高達89%，對羥自由基的清除率與其質量濃度呈線性關系，抑制亞硝胺合成的抑制率可達80%。

醬油類黑色素可以作為固體醬油、食用色素、自由基清除劑以及亞硝胺合成抑制劑等被廣泛開發(fā)和利用。我國是醬油生產(chǎn)發(fā)源地，有著豐富的醬油資源，有進行深加工的條件和基礎，類黑素粗制品可以作為功能性固體醬油被開發(fā)，類黑色素純品可以作為功能性食用色素而得到開發(fā)利用，從而使醬油的附加值及生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益將有所提高。

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Extraction, Spectral Properties and Bioactive Functions of Melanoidin from Black Soy Sauce

GUO Cai-hua1，LIN Li1，CHEN Zhao-hua1，LU Zhen-hua1，SUN Li-ping2，YU Jing1
(1. College of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Xiamen Seashine Kusu Condiment Co. Ltd., Xiamen 361000, China)

Melanoidin was extracted from black soy sauce, and its spectral properties and bioactive functions were studied.The results showed that 22.8 g of crude melanoidin could be obtained from 100 mL black soy sauce by organic solvent precipitation. The crude melanoidin was purified by removing small molecular substances with Sephadex G-50 column. The molecular weight of the purified melanoidin was in the range of 3000 to 55000 u. The UV-Vis and infrared spectra revealed that the crude melanoidin was products of the Maillard reaction and enzymatic browning. The scavenging efficiency of the crude melanoidin on DPPH free radicals and on hydroxyl free radicals were 89.0% and 89.5%, respectively. The inhibitory action on the synthesis of nitrosamine was up to 80.0%. Conclusion: crude melanoidin from soy sauce can be developed as a functional solid soy sauce. Neat melanoidin has great potential to developed as a functional food coloring.

black soy sauce；melanoidin；DPPH free radical；hydroxyl free radical

TS264.2

A

1002-6630(2012)11-0089-05

2011-08-28

福建省教育廳科研項目(JA09155)

郭彩華(1963—)，女，副教授，碩士，主要從事食品生物化學研究。E-mail：chguo@jmu.edu.cn