高冰 張勝 姜樹(shù)原 周立社 邵國(guó)

低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxicpreconditioning)是指預(yù)先給予1次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，機(jī)體獲得了對(duì)更嚴(yán)重甚至致死性缺血或缺氧的耐受性，是機(jī)體抗缺氧或缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象?，F(xiàn)已在心、肝、腎等臟器發(fā)現(xiàn)了低氧預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象，其中腦低氧預(yù)適應(yīng)的研究備受關(guān)注。低氧預(yù)適應(yīng)后腦中缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）的變化已有較多報(bào)道，但多集中于預(yù)適應(yīng)的遲發(fā)效應(yīng)。本研究著重于觀察短時(shí)間獲得預(yù)適應(yīng)后HIF-1的變化。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用呂國(guó)蔚教授的整體水平低氧預(yù)適應(yīng)模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)檢測(cè)低氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織中在HIF-1α蛋白質(zhì)水平表達(dá)的變化，探討HIF-1活化對(duì)缺氧耐受的作用，為開(kāi)展對(duì)腦缺血/缺氧研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 BSA（sigma），HIF-α兔多克隆抗體（Santa Cruz），生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（中山生物公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制 選擇6～8周齡，體重18～22克的昆明種雄性小鼠有由內(nèi)大動(dòng)物室提供。按呂國(guó)蔚教授方法復(fù)制急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)模型[1-2]。將小鼠置于含有新鮮空氣、經(jīng)過(guò)標(biāo)定約125ml的廣口瓶?jī)?nèi)，以橡皮塞密閉，記時(shí)、觀察，待小鼠出現(xiàn)喘呼吸，翻轉(zhuǎn)反射消失，立即取出，轉(zhuǎn)移至另一相同容積并含有新鮮空氣的廣口瓶?jī)?nèi)，密閉、記時(shí)，如此重復(fù)4次。實(shí)驗(yàn)分3組：空白對(duì)照組(H0)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(H1)、低氧預(yù)適應(yīng)組(H4)。

1.3 小鼠灌注 小鼠經(jīng)低氧處理后按5ml/Kg體重，給小鼠腹腔注射6%的水合氯醛。將麻醉好的小鼠仰臥固定于臘盤上。灌注裝置管道清洗干凈，用0.01M PBS沖注排除氣泡。暴露胸和腹腔，沿胸骨劍突水平向兩側(cè)剪開(kāi)皮膚至腋中線，然后向上剪至腋下，剪斷膈肌，掀開(kāi)整個(gè)胸廓，打開(kāi)心包，暴露心臟。沿腹中線向下暴露整個(gè)腹腔。在心尖即左心室部剪開(kāi)一個(gè)小口，將灌注插管插入左心室至主動(dòng)脈，固定插管。剪開(kāi)右心耳，可見(jiàn)靜脈血流出。打開(kāi)恒流灌注泵，灌注溫的（35℃～37℃）0.01M PBS緩沖液，將電壓開(kāi)至10V，將血管內(nèi)的血液全部沖干凈，當(dāng)肝臟及虹膜全變白時(shí)，可暫停灌注，時(shí)間約為5分鐘，灌注量約為100ml。隨后再灌注4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液，速度宜先快后慢，開(kāi)始電壓調(diào)為10V，當(dāng)小鼠四肢、尾部出現(xiàn)抽動(dòng)時(shí)即可將電壓調(diào)為5V，慢速注入固定液，時(shí)間約為10分鐘，灌注量約為150ml。灌注完畢后立即取小鼠完整全腦，放入4℃后固定液中進(jìn)行后固定約8個(gè)小時(shí)。取出小鼠全腦置于20%蔗糖中進(jìn)行置換。

1.4 切制免疫組織化學(xué)用腦片 待腦組織沉至瓶底表明置換完全，約12小時(shí)以上，隨后可進(jìn)行冰凍切片。將樣品托盤嵌入冰凍切片機(jī)的插槽中，用滴管滴加水在托盤上作成冰臺(tái)，冰臺(tái)在切片機(jī)中平衡10分鐘，用切片刀將冰臺(tái)切修出一平整面。從20%蔗糖中取出腦組織，用刀片修整，再放入盛有異戊烷的塑料管中，浸入液氮中快速冷卻，10秒可取出塑料管中的腦組織，小心置于冰臺(tái)的平整面上，在組織周圍滴加水形成冰托以穩(wěn)定組織塊。將樣品托盤安置并固定在樣品夾持臂上，調(diào)整切片刀和塑料擋板的位置，使組織塊快要接觸到刀口。連續(xù)切片，將組織切成厚度為40μm的腦片，置于PBS緩沖液中。腦片用PBS緩沖液洗3次，每次10分鐘可放置于4℃冰箱中備用。

1.5 免疫染色 將上述腦片置于PBST中3小時(shí)，再置于1%小牛血清（BSA）封閉液中，在室溫條件下封閉非特異抗原1小時(shí)，腦片用PBST洗3次，每次10分鐘。將腦片置于PBST稀釋的HIF-α兔多克隆抗體（1:500）中，室溫條件下在搖床上孵育16小時(shí)，將腦片和PBST稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:300）室溫下共孵育2小時(shí)，隨后再和PBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（Streptavidin）（1:300）在室溫下孵育1.5小時(shí)，PBST漂洗3次，每次10分鐘。將腦片置入新鮮配置的DAB顯色液中，顯色10分鐘。將腦片取出置于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液中終止顯色反應(yīng)。將腦片裱貼在以明膠包被好的載玻片上，室溫晾干。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。由于HIF-α定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，以出現(xiàn)棕黃色高出背景色為陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié)果

正常對(duì)照（H0）組小鼠腦部可見(jiàn)HIF-α陽(yáng)性染色，低氧一次（H1）組HIF-α染色與H0組相似，重復(fù)低氧（H4）組小鼠在大腦皮層、海馬CA1、3區(qū)錐體細(xì)胞層、分子層、多形細(xì)胞層、齒狀回處HIF-α陽(yáng)性染色均上升。

圖1 低氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦HIF-1α的表達(dá)×15A:H0組， B:H1組, C:H4組，標(biāo)尺：1mmFig.1. Expression of HIF-1αin brain of hypoxia preconditioned mice ×15 A:group H0, B：group H1, C：group H4, scale bar : 1mm

3 討論

HIF-1為異二聚體，由HIF-1α和HIF-1β組成，其中α亞單位為120kDa,穩(wěn)定性受環(huán)境氧分壓調(diào)節(jié)，而β亞單位為91或94kDa,不受環(huán)境氧分壓影響，因而在某些方面，HIF-1α的變化就可以代表HIF-1的變化。在常氧狀態(tài)，腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合在HIF-1α的ODDD區(qū)，通過(guò)泛素蛋白酶體系降解[3-4]。研究表明pVHL與HIF-1α結(jié)合的條件是HIF-1α的兩個(gè)脯氨酸（pro-402,pro-564）被羥化。羥化酶需要分子氧和Fe2＋以及抗壞血酸存在[5-6]。因此低氧或者Fe2＋的拮抗劑及類似物（Co2＋等）都能穩(wěn)定HIF-1α。HIF-1α穩(wěn)定積累后進(jìn)入細(xì)胞核中，與HIF-1β形成異二聚體并與其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子一起調(diào)節(jié)含有缺氧應(yīng)答元件的基因。

我們先前研究顯示，急性重復(fù)低氧可以增加小鼠海馬HIF-1α蛋白的表達(dá)和HIF-1的DNA結(jié)合[7]。HIF-1的腦保護(hù)主要是通過(guò)HIF-1靶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中VEGF和EPO是明確的具有腦保護(hù)作用的HIF-1的靶基因。兩個(gè)分子的腦保護(hù)作用主要表現(xiàn)在降低腦梗死體積，通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-xL實(shí)現(xiàn)的[8]。除了明確的具有腦保護(hù)作用的HIF-1的靶基因，其他的潛在的具有腦保護(hù)的HIF-1的靶分子在抗腦低氧/缺血中也有重要作用[2-9]。在眾多的HIF-1調(diào)節(jié)的基因的作用下，神經(jīng)細(xì)胞得到了保護(hù)，維持了其基本功能及高級(jí)功能[10-11]。

我們的研究顯示，低氧預(yù)適應(yīng)可以在小鼠的大腦皮層、海馬腦區(qū)及其他部位誘導(dǎo)HIF-1的表達(dá)。HIF-1在低氧預(yù)適應(yīng)中處于關(guān)鍵位置，而大腦皮層和海馬在維持腦功能中的作用是非常重要的。因此預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)小鼠大腦皮層和海馬各區(qū)HIF-1的表達(dá)，可能是腦保護(hù)形成的關(guān)鍵步驟。由于我們使用的免疫組織化學(xué)的方法研究的蛋白表達(dá)變化，其準(zhǔn)確性不高。如果輔助以激光顯微切割技術(shù)，則可以精確研究腦部各部位細(xì)胞的HIF-1表達(dá)變化情況。

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