師婧 李建強 劉玲 趙卉

自2004年由Roh等[1]系統(tǒng)進化分析法分析基因庫，從人類和其他脊椎動物基因組證實的一種新的降鈣素(CT)/降鈣素基因相關肽(CGRP)家族肽—中介素（IMD），國內(nèi)外相繼有報道證實中介素1-53對油酸致急性肺損傷和肺臟缺血再灌注損傷、心肌缺血再灌注損傷以及腎臟缺血再灌注損傷有保護作用[2-4]，但中介素1-53在急性肺損傷中與具體炎性因子關系的研究尚未見報道。已有研究證實IL-8在急性肺損傷中起致炎因子的作用，IL-23由活化的抗原遞呈細胞，主要是樹突狀細胞分泌,通過IL-23、IL-17途徑介導免疫炎癥反應，現(xiàn)研究認為IL-23參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。本課題擬通過建立脂多糖致大鼠急性肺損傷模型，觀察肺組織IL-8、IL-23表達情況，旨在探討外源性人工合成的IMD1-53對急性肺損傷的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar 大鼠48只（山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供），體重（200±20）g。

1.1.2 主要試劑 IMD1—53粉劑（美國phoenix公司）、兔抗大鼠IL-8多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）、IL-23ELISA試劑盒（上海地澤生物公司）、脂多糖（美國sigma公司）、20%烏拉坦（山西醫(yī)科大學生理實驗室）、生理鹽水。

1.2 實驗動物與分組 健康雄性Wistar大鼠48只，隨機分為3組，每組16只。正常對照組（C組）各腹腔注射生理鹽水1ml，1h后尾靜脈注射生理鹽水1ml，LPS至ALI組（ALI組）各腹腔注射生理鹽水1ml，1h后尾靜脈注射LPS 5mg/kg(溶于1ml生理鹽水中)，IMD1-53干預組（D組）各腹腔注射IMD1-532nmol/kg(溶于1ml生理鹽水中)，1h后尾靜脈注射LPS5mg/kg(溶于1ml生理鹽水中)。

1.3 動物模型建立

尾靜脈注射脂多糖5mg/kg制作大鼠急性肺損傷（ALI）模型。

1.4 標本采集及檢測方法

ALI、D組于LPS尾靜脈注射后2h、4h各處死8只大鼠，C組在生理鹽水尾靜脈注射后2h、4h各處死8只大鼠，收集標本。

1.4.1 ELISA法測血清IL-23水平 根據(jù)標準品制作標準曲線，再根據(jù)樣品吸光度值計算出對應濃度。

1.4.2 免疫組化法測肺組織中IL-8的水平 采用免疫組織化學染色（PV）法檢測大鼠肺組織IL-8的表達，應用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，結果用平均光密度值（OD）表示。

1.4.3 肺組織W/D比值測定 取1g右肺中葉組織用分析天平稱重為濕質(zhì)量，置于70℃電熱恒溫干燥箱中烤48h后稱重為干質(zhì)量，濕質(zhì)量與干質(zhì)量比值即為W/D。

1.4.4 病理檢查 取右肺中葉約1cm×1cm×1cm大小組織塊，用10%甲醛固定，予以常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組資料進行方差分析，各時點組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清中IL-23含量 與C組比較，ALI組血清IL-23含量明顯增加，并隨時間延長而增加，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），D組經(jīng)IMD1-53干預，血清IL-23含量較ALI組減少，但仍高于C組，其與其他兩組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 肺組織IL-8表達變化 IL-8免疫組織化學反應陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要分布在細胞質(zhì)和胞膜。結果顯示，ALI組高表達IL-8，主要分布在巨噬細胞、肺泡上皮細胞、小支氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞。對肺組織中IL-8表達進行相對定量，用平均光密度值（OD）表示，C組表達弱，ALI組表達明顯增強，D組表達較ALI組弱，處理后4h組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），2h組有差異，但不顯著，可能2h時中介素還未完全發(fā)揮保護作用，ALI組與C組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 肺組織W/D C組大鼠W/D比值兩時間點變化不顯著，差異無統(tǒng)計學意義，ALI組肺組織W/D比值明顯升高，各時點與C組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），D組經(jīng)IMD1-53干預后肺組織W/D比值較ALI組降低，但仍高于C組。見表1。

表1 各組大鼠各時點IL-23、IL-8的表達及W/D值的變化（±s,n=8）

表1 各組大鼠各時點IL-23、IL-8的表達及W/D值的變化（±s,n=8）

注：與C組相比aP＜0.05 與ALI組相比bP＜0.05

IL-23（ng/L） IL-8(OD值) W/D C組 處理后2h 47.17±1.29 0.220±0.019 4.32±0.24處理后4h 48.72±1.01 0.212±0.009 4.35±0.22 ALI組 處理后2h 67.46±3.36a 0.301±0.174a 5.41±0.18a處理后4h 76.47±3.65a 0.319±0.019a 5.73±0.21a D組 處理后2h 57.43±2.37ab 0.281±0.021a 4.98±0.19ab處理后4h 52.69±1.48ab 0.276±0.020ab 4.67±0.17ab

2.4 肺組織病理學變化：大體觀察C組大鼠兩肺成均勻的粉白色，表面光滑，無出血灶，無腫脹；光學顯微鏡見肺泡間隔均勻一致無增厚，可見少量炎性細胞，肺泡結構完整，肺泡腔清晰，無明顯充血水腫。ALI組兩肺出現(xiàn)程度不一的腫脹充血，重者可見散在出血點；光學顯微鏡可見彌漫性肺泡間隔增厚，部分肺泡萎陷，肺間質(zhì)彌漫性出血，肺泡腔可見大量炎性細胞浸潤及滲液。D組經(jīng)IMD1-53保護，肺組織腫脹充血、肺泡腔炎性細胞浸潤及滲液、肺泡間隔增厚及肺泡萎陷程度均較ALI組明顯減輕。見圖1～圖3。

圖1 正常組(HE×400)

圖2 急性肺損傷組(HE×400)

圖3 中介素1-53干預組(HE×400)

3 討論

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)是指機體遭受嚴重感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒及有害氣體吸入等多種因素打擊后，出現(xiàn)彌漫性肺泡毛細血管膜損傷所致肺水腫和微肺不張等病理特征，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥等。其發(fā)病機制十分復雜，目前研究認為主要有以下幾點：①炎癥反應和抗炎反應失衡；②肺泡-毛細血管膜通透性增加；③肺循環(huán)和支氣管循環(huán)的變化；④氧化應激。

IMD1-53是含53個氨基酸的preproMD95-147活性片段，近來研究用IMD1-53灌流離體大鼠心臟具有正性肌力作用和擴張冠狀動脈效應，應用IMD1-53對離體心臟缺血再灌注損傷具有顯著保護作用；用IMD1-53作用于大鼠肺缺血再灌注模型，可通過上調(diào)肺組織中PPAR-γ表達[5]、抑制氧自由基生成、中性粒細胞浸潤和脂質(zhì)過氧化作用對肺缺血再灌注損傷具有保護作用[6]；用IMD1-53干預油酸致急性肺損傷大鼠，IMD1-53可通過抑制中性粒細胞浸潤、抑制脂質(zhì)過氧化反應，對油酸致急性肺損傷大鼠有一定保護作用；這些實驗結果表明IMD1-53也是IMD基因表達的重要活性肽段[7]，其具有抗炎、抗氧化等作用，具有很強的臟器保護作用，但其在大鼠急性肺損傷模型中對具體致炎性因子的作用尚有待研究。

近年來強調(diào)炎癥反應在ALI/ARDS中的重要作用，感染、創(chuàng)傷導致ALI等器官功能損害的發(fā)展過程可分為三個階段：①局限性炎癥反應階段，損傷或感染導致炎癥介質(zhì)在組織局部釋放，誘導炎癥細胞向局部聚集，促進病原微生物清除和組織修復，對機體發(fā)揮保護作用；②有限全身炎癥反應階段，少量炎癥介質(zhì)進入循環(huán)誘發(fā)SIRS，誘導吞噬細胞和血小板向局部聚集；同時由于內(nèi)源性抗炎介質(zhì)釋放增加導致CARS，使SIRS與CARS處于平衡狀態(tài)，炎癥反應仍屬生理性，以增強局部防御作用；③SIRS/CARS失衡階段，表現(xiàn)為兩個極端，一個是大量炎癥介質(zhì)釋放入循環(huán)，刺激炎癥介質(zhì)瀑布樣釋放，而內(nèi)源性抗炎介質(zhì)又不足以抵消其作用，結果導致SIRS；另一個極端是內(nèi)源性抗炎介質(zhì)釋放過多，結果導致CARS。SIRS/CARS失衡的后果是炎癥反應擴散和失控，使其由保護性作用轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨砥茐淖饔?，不但損傷局部組織細胞，同時也打擊遠隔器官，導致ALI等器官功能損害。就其本質(zhì)而言，ALI是機體炎癥反應失控的結果，也就是SIRS/CARS失衡的嚴重后果。本實驗旨在通過測定促炎性細胞因子家族中的IL-23、IL-8在各組各時點的變化，探討IMD1-53對急性肺損傷的作用及其可能機制。

IL-23是2000年發(fā)現(xiàn)的一個IL-12細胞因子家族的新成員,與IL-12有40%的基因序列同源，IL-23主要作為一種促炎癥細胞因子而發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，急性感染過程中IL-23的產(chǎn)生很可能與中性粒細胞募集有關，樹突細胞、巨噬細胞與脂多糖和微生物接觸,幾小時內(nèi)便可產(chǎn)生IL-23,隨后刺激組織T細胞和NKT淋巴細胞分泌IL-17。IL-17刺激基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞和單核細胞亞群產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8和TNF等炎性因子。IL-8由中性粒細胞、淋巴細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞和肺巨噬細胞產(chǎn)生，是一種堿基-肝素結合性蛋白質(zhì)，具有很強的中性粒細胞趨化作用，可趨化中性粒細胞滲出到炎癥部位，參與趨化、激活中性粒細胞的全部過程。IL-8尚有抑制中性粒細胞凋亡、延長中性粒細胞壽命的功能。在肺損傷中，IL-8可使肺組織中大量的中性粒細胞聚集，并與中性粒細胞表面的特異性受體結合導致白細胞發(fā)生變形反應、脫顆粒、呼吸爆發(fā)，釋放蛋白水解酶和活性氧，引起炎癥反應，從而引起肺損傷。

本實驗結果顯示，與C組相比ALI組大鼠IL-23、IL-8兩炎性因子表達水平均明顯升高，反應肺微血管損傷及水腫程度的指標W/D也明顯上升，兩組上述3個指標差異均有統(tǒng)計學意義。經(jīng)中介素1-53干預后，與ALI組比較，IL-23、IL-8、W/D三個指標均明顯下降，但仍高于C組。肺組織病理學變化顯示：C組肺組織幾乎無損傷，ALI組損傷最重（彌漫性肺泡間隔增厚，部分肺泡萎陷，肺間質(zhì)彌漫性出血，肺泡腔可見大量炎性細胞浸潤及滲液）。D組經(jīng)IMD1-53保護，肺組織損傷較ALI組明顯減輕。

上述結果說明，IMD1-53對急性肺損傷具有保護作用。IL-23、IL-8均參與了大鼠急性肺損傷過程，給予IMD1-53干預后可顯著降低二者在肺組織表達。據(jù)此可推斷IMD1-53對急性肺損傷的保護作用可能是通過抑制促炎性細胞因子如IL-23、IL-8的表達，從而抑制炎性細胞浸潤，減少炎癥因子的釋放來實現(xiàn)的。外源性補充IMD1-53可能成為防止ALI的新途徑，但其與炎性因子的相互作用機制復雜，其在免疫炎癥反應中的作用尚有待進一步深入研究。

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