張旺璧，薛 莉

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，太原030006）

羊肚菌（Morchella conica）是一種食用藥用價值很高的大型真菌，羊肚菌（Morchella.denta L.）又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，按Ainsworth分類系統(tǒng)隸屬于子囊菌亞門（Aseomycotina）、盤菌（Diseomyeetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）［1］。羊肚菌具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是一種大型的食用兼藥用真菌。羊肚菌是著名的野生食用菌，它不僅營養(yǎng)豐富、味道鮮美，而又是主治消化不良、痰多氣短的良好中藥［2］。

長期以來，由于羊肚菌野生資源匱乏，滿足不了市場需求，因此許多食用菌工作者對其進(jìn)行人工栽培方面的研究?？墒牵捎谘蚨蔷訉嶓w對其繁衍條件和生長環(huán)境的要求十分苛刻，導(dǎo)致規(guī)模化人工栽培方面的研究尚無實質(zhì)性突破。至今，國內(nèi)關(guān)于此類研究報道很多，但是，羊肚菌仍不能像香菇、杏鮑菇、白靈菇等菌類產(chǎn)品那樣成功實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，進(jìn)入市場［3］

羊肚菌菌絲體不僅含有子實體的各種營養(yǎng)成分，還具有子實體獨特的風(fēng)味，而且液體發(fā)酵可以進(jìn)行工業(yè)化的連續(xù)生產(chǎn)，具有規(guī)模大、菌絲體產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高等優(yōu)點［4］。筆者通過正交試驗，確定羊肚菌的最優(yōu)液體培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵工藝條件，最終達(dá)到菌絲發(fā)酵生產(chǎn)的小試生產(chǎn)規(guī)模，以求對系統(tǒng)開發(fā)菌類產(chǎn)品、提高菌類產(chǎn)品的價值產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義。

羊肚菌Ydj0705菌種分離、液體發(fā)酵工藝研究，其目的是應(yīng)用液體培養(yǎng)菌絲發(fā)酵技術(shù)，完成羊肚菌的菌種分離與培養(yǎng)、生物學(xué)特性研究、培養(yǎng)基篩選及培養(yǎng)工藝條件的確定。通過羊肚菌Ydj0705菌絲的多糖含量測試及S180抑瘤試驗證明，該菌絲多糖含量與國內(nèi)相關(guān)報道的發(fā)酵工藝所得的菌絲多糖含量相比，含量要高；同時其小鼠S180試驗抑瘤率為80%。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

羊肚菌Ydj0705菌種子實體于2007年5月初采自山西關(guān)帝山。該地氣候特點是四季分明，氣候溫和，屬溫帶大陸性氣候。從海拔1 300～2 830m的主峰，氣候差異較大，氣候垂直變化明顯。年平均氣溫約－4～22℃。夏季峰頂平均氣溫在16.5℃。植物以寒溫性針葉林為中心區(qū)，溫性針葉林為外圍，山地落葉闊葉林為過渡帶的整體格局，羊肚菌就生長于山地落葉闊葉林過渡帶中。羊肚菌分離、純化過程如圖1所示。

圖1 羊肚菌分離、純化過程

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（PDA）。馬鈴薯去皮鮮重200 g，葡萄糖20g，瓊脂18g，pH自然。

2）液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。萄萄糖30g，蛋白胨10g，KH2PO41.0g，MgSO40.75g，pH 為6.0.

1.1.3 主要藥品與儀器設(shè)備

瓊脂購自山西太原雙鶴藥業(yè)有限公司；玉米粉、黃豆粉購于山西省農(nóng)科院，用前過60目篩；葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、尿素等購于國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備為LDZX－40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-ICU雙人單面凈化工作臺、HYG-B全溫度搖瓶柜。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體種子培養(yǎng)液制備

將4℃保藏的羊肚菌菌種轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基，置28℃中培養(yǎng)，菌絲基本長滿斜面?zhèn)溆?。在無菌條件下，從PDA斜面上挑取1cm2劃碎后的羊肚菌Ydj0705的菌絲體，接入到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150r／min，培養(yǎng)7d得一級種子培養(yǎng)液。按10%的接種量，將一級種子液接入到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于28℃的搖床上振蕩培訓(xùn)7d得二級種子液，備用。

1.2.2 菌絲體生物量的測定方法

定量取發(fā)酵液，3 000r／min離心10min，棄上清液，所得菌絲體用蒸餾水洗再離心，反復(fù)洗滌離心三次后，置于60℃干燥箱中烘干，并稱重［5］。計算出每毫升發(fā)酵液中的菌絲體生物量（mg／mL）。

1.2.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

1）碳源篩選試驗。將液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖分別用等量玉米粉（玉米粉需煮沸取汁）、可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、玉米粉＋葡萄糖、可溶性淀粉＋葡萄糖、玉米粉＋蔗糖替換，培養(yǎng)條件與種子培養(yǎng)條件相同，每組設(shè)三個重復(fù)，考察不同碳源及其組合對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

2）氮源篩選試驗。將液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨分別用黃豆粉（24g／L，黃豆粉需煮沸取汁）、酵母粉（28g／L）、硝酸銨（3g／L）、硫酸銨（8 g／L）、黃豆粉（12g／L）＋酵母粉（14g／L）、酵母粉（14g／L）＋蛋白胨（5g／L）替換，培養(yǎng)條件與種子培養(yǎng)條件相同，每組設(shè)三個重復(fù)，考察不同碳源對羊肚菌菌絲體生物量的影響。各氮源在每升培養(yǎng)基中添加量根據(jù)各自的全氮含量相對于10g蛋白胨全氮含量折算［6］。

3）培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗。根據(jù)以上試驗結(jié)果，對玉米粉、葡萄糖、黃豆粉、蛋白胨以及無機(jī)鹽KH2PO4和MgSO4進(jìn)行正交試驗，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方，選用正交表L18（37）［3］，以菌絲體生物量為考察指標(biāo)，設(shè)計正交試驗，各處理均設(shè)3個重復(fù)，如表1所示。

表1 培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化試驗設(shè)計表 g／L

1.2.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上，設(shè)定不同溫度、pH、裝液量、接種量和轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)定培養(yǎng)溫度26℃，轉(zhuǎn)速150r／min；以培養(yǎng)基初始pH、裝液量和接種量為主要影響因素，選定不同水平；以菌絲體生物量為考察指標(biāo)，選用正交表L9（34）進(jìn)行試驗，優(yōu)化最佳發(fā)酵條件。

表2 液體培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗設(shè)計表

1.2.5 羊肚菌Ydj0705液體培養(yǎng)菌絲體生物量變化

按照篩選出的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，進(jìn)行羊肚菌液體發(fā)酵，每隔12h取樣一次，考察菌絲體生物量的變化情況。

2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗結(jié)果

2.1 羊肚菌Ydj0705的最優(yōu)碳源篩選結(jié)果

不同碳源對羊肚菌液體培養(yǎng)菌絲體生物量的影響見圖2所示。試驗結(jié)果表明，羊肚菌在6種常用碳源中均可生長，但不同碳源對菌絲體生物量的差異較大。其中，玉米粉＋葡萄糖作為碳源時菌絲體生物量較高，以玉米粉和葡萄糖作為復(fù)合碳源時菌絲體生物量最高。因此，選用玉米粉和葡萄糖作為羊肚菌液體發(fā)酵的最佳碳源。

圖2 羊肚菌Yd0705最佳碳源篩選結(jié)果

2.2 羊肚菌Ydj0705的最優(yōu)氮源篩選結(jié)果

氮源是構(gòu)成真菌菌體蛋白質(zhì)、核酸的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮兩類。不同氮源對羊肚菌液體培養(yǎng)菌絲濃度影響見圖3所示。試驗結(jié)果表明，羊肚菌能較好地利用有機(jī)氮源，而對無機(jī)氮的利用較差。其中，黃豆粉加酵母粉作為羊肚菌氮源時菌絲體生物量較高，因此，試驗選用黃豆粉加酵母粉作為羊肚菌氮源。

圖3 羊肚菌Yd0705最佳氮源篩選結(jié)果

2.3 培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化試驗結(jié)果

選取 A（玉米粉）、B（葡萄糖）、C（黃豆粉）、D（酵母粉D）、E（KH2PO4）和F（MgSO4）作為正交試驗因素，正交優(yōu)化試驗直觀分析結(jié)果見表3，方差分析見表4。試驗結(jié)果表明，以羊肚菌菌絲體生物量為考察指標(biāo)，6因素對羊肚菌菌絲體液體發(fā)酵影響的顯著性次序為：玉米粉＞黃豆粉＞MgSO4＞酵母粉＞KH2PO4＞葡萄糖，即玉米粉對羊肚菌菌絲體生物量影響最為顯著，其次是黃豆粉。羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配比為A2B2C3D2E3F2，即玉米粉30g／L，葡萄糖10g／L，黃豆粉20g／L，酵母粉5 g／L，KH2PO4和MgSO4適量，羊肚菌菌絲體生物量可達(dá)11.69mg／mL。

表3 培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化試驗結(jié)果

表4 培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化試驗方差分析

2.4 羊肚菌Ydj0705液體培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

設(shè)定溫度為26℃，轉(zhuǎn)速150r／min條件下，以培養(yǎng)基初始pH、裝液量和接種量為主要影響因素，選取不同水平進(jìn)行正交試驗。培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗結(jié)果見表5所示。試驗結(jié)果表明，以羊肚菌菌絲體生物量為考察指標(biāo)，三因素對羊肚菌菌絲體液體發(fā)酵影響的顯著性次序為：初始pH＞接種量＞裝液量，即初始pH對羊肚菌菌絲體生物量影響最為顯著，其次是接種量。

表5 培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗結(jié)果

2.5 羊肚菌Ydj0705液體培養(yǎng)菌絲體生物量變化結(jié)果

真菌菌絲體生物量是真菌液體發(fā)酵的重要參考指標(biāo)［7］，羊肚菌Ydj0705液體培養(yǎng)菌絲體生物量變化結(jié)果見圖4所示。由圖可知，0～48h為延滯期，羊肚菌生長緩慢；48～120h為對數(shù)期，羊肚菌菌絲球快速增長，并在120h時達(dá)到高峰，菌絲體生物量可達(dá)到13.645mg／mL；120h以后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，在衰亡期羊肚菌菌絲體開始自溶，菌絲體生物量開始下降。

3 討論與結(jié)論

圖4 羊肚菌Ydj0705液體培養(yǎng)菌絲體生物量變化

通過課題組成員采集、分離、培養(yǎng)，得到一種新菌株Ydj0705。對Ydj0705進(jìn)行了液體發(fā)酵培養(yǎng)、培養(yǎng)基考察及培養(yǎng)條件考察，篩選出一套最佳配方。在羊肚菌Ydj0705液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化方面，主要選取碳、氮源以及一些無機(jī)鹽為主要因素。碳素是真菌最基礎(chǔ)、最重要的營養(yǎng)元素，是碳水化合物和蛋白質(zhì)的基本組成元素，又是真菌重要的能量來源。在液體發(fā)酵過程中，碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，既是菌絲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，又是菌絲體產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)的重要原料［7］。玉米粉、葡萄糖作為復(fù)合碳源時，菌絲體生物量較高，這可能由于葡萄糖作為速效碳源有利于縮短發(fā)酵延滯期，而玉米粉作為長效碳源，可能含有羊肚菌生長所需的一些微量元素，能夠促進(jìn)羊肚菌生長。氮源是構(gòu)成真菌菌體蛋白質(zhì)、核酸的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮兩類［8］。羊肚菌能較好地利用有機(jī)氮，不能利用無機(jī)氮源。此外，培養(yǎng)基中若缺乏P、K、Mg等元素時，真菌菌絲體生長發(fā)育不良［9］。因此，在培養(yǎng)基中選用了磷酸二氫鉀和硫酸鎂。

預(yù)備試驗表明，羊肚菌培養(yǎng)溫度在24～28℃，搖床轉(zhuǎn)速140～180r／／min之間時，菌絲體生物量變化不明顯，因此選擇初始pH、裝液量和接種量為主要影響因素。適宜的初始pH不但可以縮短發(fā)酵延滯期，也有利于菌絲體快速生長繁殖［10］。接種量的大小決定菌絲體的生長狀況，接種量高可縮短延滯期，但會導(dǎo)致菌絲體生長過快，造成營養(yǎng)缺乏或溶氧不足，不利于代謝物積累［11］。裝液量的大小決定了培養(yǎng)基中的溶氧量，影響到菌絲體的生長量和代謝物的產(chǎn)生、積累［12］。因此，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對羊肚菌液體發(fā)酵至關(guān)重要。

羊肚菌液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為：玉米粉30g／L，葡萄糖10g／L，黃豆粉20g／L，酵母粉5g／L，KH2PO4和MgSO4適量等；最優(yōu)液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速定量，培養(yǎng)基初始pH為6.0，裝液量為100mL培養(yǎng)液，接種量體積分?jǐn)?shù)為10%，發(fā)酵時間6 d。羊肚菌搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)為今后開展發(fā)酵罐中試試驗，探索羊肚菌菌絲體規(guī)?；a(chǎn)的工藝條件 奠定了基礎(chǔ)。

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