徐瑩瑩 杜秉海 丁延芹 王翠翠 王璇 姚良同

摘要：從生姜根際土樣分離獲得了65個(gè)細(xì)菌分離物和42個(gè)放線(xiàn)菌分離物，通過(guò)離體拮抗試驗(yàn)，篩選出對(duì)姜瘟病有良好拮抗效果的細(xì)菌一株，放線(xiàn)菌兩株，編號(hào)分別為H16－8、WFl和JW02－6。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及16S rDNA序列分析，初步確定：H16－8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，WF1為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，JW02-6為勞倫鏈霉菌(Streptomyces laurentii)。H16-8、WFl和JW02-6的16SrDNA序列的GenBank登錄號(hào)分別為：EU812754，F(xiàn)J972686和FJ972687。

關(guān)鍵詞：生姜根際；姜瘟??；拮抗菌；篩選；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S476⁺.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2012)01-0079-05

姜瘟病主要是由青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)引起的。每年6～8月是該病發(fā)生和流行的高峰時(shí)期，此時(shí)北方正值高溫高濕天氣，是姜塊形成膨大旺盛期，病菌易侵入，侵染速度快，嚴(yán)重的可在半月左右造成全田無(wú)收，成為制約生姜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的毀滅性病害之一。篩選抗病品種、施用化學(xué)農(nóng)藥等措施可防治姜瘟病的發(fā)生，但是輪作和篩選抗病品種周期長(zhǎng)，使用化學(xué)農(nóng)藥不僅不能從根本上防治病原菌，又帶來(lái)了環(huán)境污染。而生物防治既可限制病原菌青枯假單胞菌的生長(zhǎng)，又增加了根際有益微生物的數(shù)量和抑菌物質(zhì)的含量，是一種行之有效的方法。目前，雖然已有一些可防治姜瘟病的菌種被發(fā)現(xiàn)，但是大多存在著難以在生姜根際長(zhǎng)期定殖的問(wèn)題。

本研究討論的拮抗菌分離自生姜根際土壤，有利于其在根際的定殖，此外，拮抗菌的應(yīng)用還可以有效地促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。從山東萊蕪采集發(fā)病區(qū)生姜根際土壤樣品，篩選到對(duì)姜瘟病具有很好生防應(yīng)用潛力的細(xì)菌1株，放線(xiàn)菌2株，其中H16-8被鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，WF1被鑒定為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fra-diae)，JW02-6被鑒定為勞倫鏈霉菌(Streptomy-ces laurentii)。

1.材料與方法

1.1材料

生姜根際土壤樣品：采集自山東省萊蕪市。

供試病原菌：姜瘟病病原菌——青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)，由山東省萊蕪市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，細(xì)菌及放線(xiàn)菌菌種鑒定培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[12，13]。

試劑：分子生物學(xué)試劑購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，DNA小量快速純化試劑盒(3S SpinAgarose Gel DNA purification Kit)購(gòu)于上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2拮抗菌的篩選

分別采用細(xì)菌和放線(xiàn)菌培養(yǎng)所需的不同培養(yǎng)基，通過(guò)梯度稀釋法，從生姜根際土樣中分別獲得細(xì)菌和放線(xiàn)菌分離物。采用稀釋涂布平板法，即取100μl經(jīng)12h培養(yǎng)的病原菌菌液涂布于拮抗篩選培養(yǎng)基平板上，再將待試菌接種于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24-48h，通過(guò)觀察抑菌圈的有無(wú)及大小進(jìn)行拮抗活性檢測(cè)，篩選出對(duì)姜瘟病病原菌具拮抗活性的細(xì)菌和放線(xiàn)菌，分別記錄其編號(hào)，并轉(zhuǎn)接到相應(yīng)分離培養(yǎng)基斜面上保存。

1.3菌種鑒定

形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性檢測(cè)及16SrDNA序列的擴(kuò)增方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13，14]。

1.4DNA提取和PCR反應(yīng)

具體方法參閱文獻(xiàn)[15，16]，用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基接種拮抗菌，培養(yǎng)24h，收集菌液提取總DNA。

PCR反應(yīng)體系為：Taq DNA聚合酶0.5μl，10×Buffer(Mg²⁺)2.5μl，dNTP(10mmol/L)0.5μl，引物1μl，模板1μl，ddH₂O補(bǔ)足至25μl。

反應(yīng)條件：95℃5min；94℃1min；56℃1min，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量，陜速純化試劑盒(3S spin Agarose Gel DNA purification kit)純化PCR產(chǎn)物。

1.5 16S rDNA序列測(cè)定及分析

16S rDNA的測(cè)序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，序列相似性分析通過(guò)NCBI的BLAST程序比對(duì)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，利用MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining算法和Jukes-Cantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。自展次數(shù)設(shè)定為1000，自展檢驗(yàn)結(jié)果低于50的數(shù)值不顯示在圖上。

2.結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的篩選

通過(guò)梯度稀釋法從生姜根際土壤樣品中篩選出65個(gè)細(xì)菌分離物和42個(gè)放線(xiàn)茵分離物。經(jīng)過(guò)初篩及復(fù)篩，獲得拮抗效果良好且穩(wěn)定的細(xì)菌1株，編號(hào)為H16-8；放線(xiàn)菌2株，編號(hào)為WF1和JW02-6。

從圖1中可以看出，H16-8、WF1和JW02-6都對(duì)Pseudomonas solanacearum具有較好的拮抗效果。

2.2形態(tài)學(xué)特征

H16-8的菌體大小為(0.50～0.55)μm×(1.10～1.20)μm，G⁺，短桿狀，產(chǎn)芽孢且孢囊膨大，在LB平板上培養(yǎng)24h后，菌落為微黃色，粘稠厚重，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣較規(guī)則。WF1孢子絲直或柔曲，孢子卵圓形或不規(guī)則圓形，表面光滑；JW02-6孢子絲直、彎曲，孢子卵圓形，表面光滑(圖2)。

2.3生理生化特性

菌株H16-8在牛肉膏蛋白胨和LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均形成微黃色不透明菌落，而在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)則形成乳白色粘稠不透明菌落；WF1和JW02-6的培養(yǎng)特性見(jiàn)表1。

H16-8、WF1和JW02-6的主要生理生化特性見(jiàn)表2和表3。其中，細(xì)菌菌株H16-8與其模式種在大多數(shù)生理生化指標(biāo)上具有相同的特征，但在pH5.5及50℃條件下的生長(zhǎng)情況與模式菌株性狀不符，說(shuō)明H16-8更耐酸、耐熱。根據(jù)放線(xiàn)菌的分類(lèi)和鑒定，WF1和JW02-6具有典型的鏈霉菌屬特征。其中，WF1與鏈霉菌屬弗雷德氏鏈霉菌的生物學(xué)特性相似，如弗雷德氏鏈霉菌可水解淀粉，使明膠液化和牛奶胨化，分解纖維素，硝酸鹽還原力強(qiáng)，不產(chǎn)生H₂S，但WF1不能分解纖維素，且兩者的碳源代謝不完全一致，弗雷德氏鏈霉菌可利用葡萄糖、果糖和蔗糖，而WF1僅能利用果糖。鏈霉菌屬勞倫鏈霉菌可水解淀粉，使明膠液化，可利用阿拉伯糖、果糖和甘露醇，而JW02-6能利用葡萄糖和木糖，不能利用甘露醇。篩選菌株與模式菌株之間的這些不同性狀，可能是菌株間確實(shí)存在差異，也可能是由菌株不

同生長(zhǎng)環(huán)境造成的。

2.4 16S rDNA序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，如圖3所示。

經(jīng)測(cè)序分析，由菌株H16-8、WF1和JW02-6總DNA擴(kuò)增的16S rDNA序列長(zhǎng)分別為：1413bp，1406bp和1400bp，將得到的序列提交GenBank獲得注冊(cè)號(hào)：EU812754、FJ972686和FJ972687。

如圖4所示，H16-8位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)分支中，與Brevibacillusbrevis(AY887081)有較近的親緣關(guān)系。圖5則顯示菌株WF1和JW02-6都位于鏈霉菌屬(Strep-tomyces)分支中，分別與Streptomyces fradiae(AB184068)和Streptomyces laurentii(AB184669)有較近的親緣關(guān)系。

通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀及生理生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析，可以初步判定拮抗細(xì)菌H16-8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，拮抗放線(xiàn)菌WF1為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，JW02-6為勞倫鏈霉菌(Streptomyces laurentii)。

3.討論與結(jié)論

生物防治可作為解決土傳病害的一條有希望的途徑。利用拮抗菌防治植物病害已被認(rèn)識(shí)和廣泛應(yīng)用，從自然界尋找和篩選新的生防菌對(duì)生物防治具有重大意義。因此，利用拮抗菌防治姜瘟病具有廣闊的應(yīng)用前景。

但一些實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)良好的生防菌株在進(jìn)行田間試驗(yàn)時(shí)，出現(xiàn)拮抗效果不穩(wěn)定的現(xiàn)象，這主要與生防菌在作物根際的定殖能力、競(jìng)爭(zhēng)作用及外界環(huán)境影響等因素有關(guān)。生防細(xì)菌防病效果取決于它在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間定殖于適當(dāng)?shù)奈恢?，并產(chǎn)生適量的抗菌物質(zhì)，不同環(huán)境條件下生防細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的量不同。本試驗(yàn)從微生物生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，從生姜根際篩選得到了具有較好應(yīng)用潛力的3個(gè)拮抗菌菌種資源短短芽孢桿菌H16-8，弗雷德氏鏈霉菌WF1和勞倫鏈霉菌JW02-6。目前關(guān)于植物細(xì)菌性青枯病的生物防治，國(guó)內(nèi)外研究工作很多，但針對(duì)姜瘟病的研究則較少。同時(shí)，鏈霉菌可產(chǎn)生眾多次生代謝產(chǎn)物，已經(jīng)成為重要的生防菌種而被廣泛研究。而本實(shí)驗(yàn)也證明了兩株分別屬于弗雷德氏鏈霉菌和勞倫鏈霉菌的放線(xiàn)菌菌株對(duì)部分致病菌具有拮抗能力。

利用這些具有生防能力的菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物制備生物農(nóng)藥，具有無(wú)污染、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)所獲得拮抗菌可作為進(jìn)一步研究姜瘟病拮抗菌拮抗機(jī)制的實(shí)驗(yàn)材料，深入探討其生防機(jī)制及應(yīng)用前景，促進(jìn)高效低毒農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用。

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