邱瑞桂 靳世英 徐和 徐平華 靳士曉 孟小林 袁海龍 韓晉

小菜蛾抗菌肽(pxCECA1 from Plutella xylostella，CA)屬于動(dòng)物抗菌肽，是從昆蟲(chóng)小菜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)提取分離而得，具有抗菌活性高，抗菌譜廣的特點(diǎn)［1］。而且由于抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞其完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出胞外而死亡。這一獨(dú)特的抗菌靶位點(diǎn)和新的抗菌機(jī)制，使得細(xì)菌難以對(duì)抗菌肽產(chǎn)生抗藥性，從而能有效抑制和殺死耐藥性病原菌［2］。但CA 易降解變質(zhì)，經(jīng)純化的CA 在室溫下放置5 天將會(huì)發(fā)生降解，而且隨溫度的增高，降解速率越快，注射給藥后，體內(nèi)分解破壞快［1］。

脂質(zhì)體(liposomes)是由一種或多種兩親性分子雙層膜包裹而成的具有一個(gè)或多個(gè)水性腔室的微泡，將藥物包裹或鑲嵌在脂質(zhì)體中形成脂質(zhì)體藥品。脂質(zhì)體作為活性物質(zhì)的載體，具有緩釋和促進(jìn)透皮吸收作用的功能，若將CA 制成脂質(zhì)體，有望提高藥物的穩(wěn)定性及利用率［3］。脂質(zhì)體的制備方法很多，有薄膜法、復(fù)乳法、逆相蒸發(fā)法、乙醚注入法、反復(fù)凍融法等［4］，由于CA 的熱不穩(wěn)定性，筆者采用薄膜超聲聯(lián)合反復(fù)凍融法制備CA 脂質(zhì)體，最后將其冷凍干燥成粉末，并對(duì)其形態(tài)、粒徑及分布、包封率、加速穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，為CA 脂質(zhì)體劑型提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent ll00 高效液相色譜儀(含在線(xiàn)脫氣機(jī);四元梯度泵;自動(dòng)進(jìn)樣器;DAD 檢測(cè)器;HP Chem．station 化學(xué)作站，Agilent 公司);掃描電鏡(S-4800，日立，日本);NanoZS90 粒徑分析儀(Malvern 公司);渦旋混合器(WH861，北京科爾德科貿(mào)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海醫(yī)械專(zhuān)機(jī)廠(chǎng));冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco 公司)。

CA 原料藥(98．6%，批號(hào):20120421，由解放軍302 醫(yī)院藥學(xué)部制劑研究室自制)、CA 對(duì)照品(99.8%，批號(hào):20120405，由武漢大學(xué)提供);卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司);膽固醇(天津市博迪化工有限公司);甘露醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2．1 CA 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備。按優(yōu)化處方，稱(chēng)取卵磷脂、膽固醇，置圓底燒瓶中，加入氯仿20 ml 溶解，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸除有機(jī)溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。將300 μg CA 溶入含有5%甘露醇的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．5)，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時(shí)間后，冰水浴探頭超聲15 分鐘，即得CA 脂質(zhì)體混懸液?；鞈乙悍湃耄?0 ℃冰箱冷凍24 小時(shí)一定時(shí)間，然后在室溫下解凍，反復(fù)凍融，經(jīng)冷凍干燥后即得CA 脂質(zhì)體凍干粉。

2．2 正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體處方

經(jīng)單因素試驗(yàn)預(yù)試，確定對(duì)包封率影響較大的因素為卵磷脂與膽固醇比值(A)，卵磷脂與CA 比值(B)，水化體積(C)，凍融次數(shù)(D)，各因素設(shè)3 個(gè)水平(如表1)。以藥物包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，脂質(zhì)體粒徑及分布為輔助，按L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排正交試驗(yàn)，確定CA 脂質(zhì)體的最優(yōu)處方及工藝。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表

由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，各因素對(duì)藥物包封率影響大小的順序?yàn)锽 ＞A ＞D ＞C。得到各因素的最佳組合為A3B2C2D3，即卵磷脂與膽固醇比值為4∶ 1，卵磷脂與CA 比值為20∶ 1，水化體積為10 mL，凍融3 次。隨著凍融次數(shù)的增加，藥物的包封率得到了增加，但脂質(zhì)體的粒徑分布也隨之增大，從而增大了CA 脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性。綜合考慮對(duì)包封率與粒徑的影響，最終確定以?xún)鋈? 次為佳。

2．3 CA 脂質(zhì)體掃描電鏡形態(tài)觀(guān)察

將脂質(zhì)體粉末均勻涂在掃描電鏡樣品池上，表層噴金以獲得更好的導(dǎo)電率，將樣品池置于掃描電鏡內(nèi)觀(guān)察，掃描電壓設(shè)為1．5 KV。可見(jiàn)CA 脂質(zhì)體粒子均勻、圓整，為球形或類(lèi)球形，見(jiàn)圖1。

2．4 CA 脂質(zhì)體粒徑及分布測(cè)定

CA 脂質(zhì)體復(fù)溶后用水稀釋?zhuān)?jīng)激光散射粒度分析儀測(cè)定脂質(zhì)體粒徑及分布。結(jié)果表明，CA 脂質(zhì)體粒度分布較均勻，平均粒徑為(223．1±31．2)nm，多分散性指數(shù)為0．189。粒徑分布圖見(jiàn)圖2。

圖1 CA 脂質(zhì)體掃描電鏡圖

圖2 CA 脂質(zhì)體粒徑分布圖

2．5 CA 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

2．5．1 HPLC 測(cè)定CA 含量方法的建立

HPLC 色譜條件:色譜柱為Agilent Alltima C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0．05%三氟乙酸(TFA)溶液－甲醇－乙腈(95∶ 2．5∶ 2．5)，用前經(jīng)0．45 μm 濾膜濾過(guò)，流速1．0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫25 ℃。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取CA 對(duì)照品5．0 mg，置50 ml 量瓶中，加純凈水溶解并稀釋至刻度，得100 μg/ml CA 對(duì)照品儲(chǔ)備液。

線(xiàn)性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng) 相 分 別 配 制 成1．25、2．5、5、12．5、25 和50 μg/ml系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件，分別精密吸取10 μl 進(jìn)樣，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量(μg)作線(xiàn)性回歸。得線(xiàn)性回歸方程為(n=6):Y=4．046×104X+1．034×103，r=0．9994。結(jié)果表明，抗菌肽濃度在1.25 ～50 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度與回收率:分別取低、中、高三個(gè)濃度(2．5、12．5、37．5 μg/ml)的CA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6 次，連續(xù)6 天測(cè)定，計(jì)算得出日內(nèi)、日間RSD 分別為1．87%、1．65%、1．53%和2．51%、1．97%、1.59%。平均回收率為99．7%、100．4%、100．7%，RSD 為1．68%。

2．5．2 包封率的測(cè)定

凍干前:精密量取CA 脂質(zhì)體混懸液200 μl 置10 ml 量瓶中，加入1 ml 乙醇，超聲20 分鐘，放冷至室溫，用流動(dòng)相定容，進(jìn)樣測(cè)定總藥物量。另取脂質(zhì)體混懸液適量置1．5 ml 離心管中，8000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，精密量取上清液200 μl 置10 ml 量瓶中，同上操作，測(cè)定游離藥物量，計(jì)算包封率。

凍干后:精密稱(chēng)取CA 脂質(zhì)體凍干粉5 mg 置5 ml量瓶中，加蒸餾水復(fù)溶，搖勻，得脂質(zhì)體混懸液。精密量取脂質(zhì)體混懸液200 μl 置10 ml 量瓶中，加乙醇1 ml，超聲20 分鐘，放冷至室溫，用流動(dòng)相定容，進(jìn)樣測(cè)定總藥物量。另取脂質(zhì)體混懸液適量置1．5 ml 離心管中，8000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，精密量取上清液200 μl 置10 ml 量瓶中，同上操作，測(cè)定游離藥物量，計(jì)算包封率。結(jié)果，CA 脂質(zhì)體在冷凍干燥前的平均包封率為59%，在經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理后，其包封率得到了提高。同時(shí)，粒徑和多分散指數(shù)也相應(yīng)增大。見(jiàn)表2。

表2 CA 脂質(zhì)體凍干前后的指標(biāo)變化

2．6 CA 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

分別在4 ℃和25 ℃下，將凍干后的CA 脂質(zhì)體樣品放置3 個(gè)月，于0、1、2、3 月取樣，考察脂質(zhì)體的外觀(guān)、再分散性、含量、滲漏率、粒徑及多分散指數(shù)?？疾旖Y(jié)果顯示，4 ℃下保存的脂質(zhì)體凍干品為類(lèi)白色塊狀物，隨時(shí)間無(wú)明顯變化，而25 ℃下保存的樣品隨時(shí)間的推移逐漸變?yōu)榈S色塊狀物。各時(shí)間點(diǎn)取樣加水振搖進(jìn)行再分散，25 ℃下貯存的CA 脂質(zhì)體的再分散性明顯比4 ℃條件下的樣品要慢，且伴有膠狀物長(zhǎng)時(shí)間不能分散。4 ℃條件下的各時(shí)間點(diǎn)CA 脂質(zhì)體樣品均能在2 分鐘內(nèi)快速分散成均勻的混懸液，再分散性良好。25 ℃條件下，CA 脂質(zhì)體滲透率、粒徑及多分散性均顯著高于4 ℃下樣品的相應(yīng)指標(biāo)，穩(wěn)定性顯著降低。見(jiàn)表3。(滲漏率=儲(chǔ)存一定時(shí)間后滲漏到介質(zhì)中的藥量/儲(chǔ)存前包封的藥量×100%)

表3 CA 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察指標(biāo)變化表

3 討論

親水性藥物脂質(zhì)體無(wú)論是在制備還是儲(chǔ)存過(guò)程中都存在一個(gè)滲漏的問(wèn)題，藥物分配在外水相增多，使包封率降低。反復(fù)凍融法被證明是一種有效的保護(hù)藥物不滲漏的方法［4-5］。與其他方法相比，凍融法具有操作簡(jiǎn)單、包封率高、藥物避免接觸有機(jī)溶媒等特點(diǎn)，且制備過(guò)程無(wú)需加熱，尤其適用于對(duì)熱不穩(wěn)定的水溶性藥物。本研究采用薄膜分散聯(lián)合凍融法制備了CA 脂質(zhì)體，并對(duì)其形態(tài)、粒徑、zeta 電位、包封率及貯存穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。

試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選制備的CA 脂質(zhì)體粒子均勻、圓整，為球形或類(lèi)球形，平均粒徑為(223．1±31．2)nm，多分散性指數(shù)為0．189，zeta 電位為－35．8 mV。多分散指數(shù)與zeta 電位是評(píng)價(jià)膠體分散體系物理穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，上述試驗(yàn)結(jié)果預(yù)示了CA 脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

為了降低CA 脂質(zhì)體在冷凍、融化和水合過(guò)程中的破壞，作者在處方中加入了甘露醇作為冷凍防護(hù)劑。采用薄膜分散聯(lián)合凍融法制備的CA 脂質(zhì)體包封率為62%，相比未經(jīng)過(guò)凍融處理的樣品包封率提高了12%。凍融法提高包封率的機(jī)理可能是由于冰凍使磷脂周?chē)幬餄舛仍龈撸诜磸?fù)凍融過(guò)程中粒徑小的脂質(zhì)體互相融合成稍大脂質(zhì)體，粒徑趨于均勻化，使脂質(zhì)體包封率明顯提高［6］;也有學(xué)者認(rèn)為凍融法提高包封率的機(jī)理可能是形成了某種暫時(shí)的孔洞使藥物在平衡前由外相進(jìn)入了內(nèi)水相中［7］。在凍融過(guò)程中，本課題組以包封率為指標(biāo)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨凍融次數(shù)的增加，CA 包封率逐漸增加，但同時(shí)脂質(zhì)體粒徑分布也隨之明顯增大，增加了藥物制劑貯存的不穩(wěn)定性，所以在保證包封率較高的前提下，本課題組選擇了凍融2 次為最佳工藝，脂質(zhì)體平均粒徑控制在223 nm左右。

最后本課題組采用冷凍干燥法將CA 脂質(zhì)體制成干粉以降低磷脂及藥物的氧化和水解速度，同時(shí)，凍干保護(hù)劑也保持了脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的完整性，克服脂質(zhì)體聚集、融合及藥物滲漏等不穩(wěn)定因素［8-9］，解決了CA 脂質(zhì)體長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性問(wèn)題。

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