北京市藥品審評中心（100053）馬書章 田曉娟 佟利家

核酸檢測（Nucleic acid testing，NAT）技術作為血液篩查的一種新方法，可顯著縮短檢測方法的“窗口期”，降低輸血感染病毒的風險，因此，該技術已成為美國、日本等發(fā)達國家血源篩查的必要手段[1][2][3][4][5]。根據(jù)我國現(xiàn)行法規(guī)要求，用于血源篩查的體外診斷試劑按照藥品管理。目前，國內(nèi)許多企業(yè)已經(jīng)開發(fā)出成熟的NAT定量檢測產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品均只能獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）的臨床診斷使用許可，而臨床診斷和血液篩檢是兩個不同的應用領域，血液篩查對試劑的要求比臨床診斷嚴格很多?，F(xiàn)就NAT血源篩查的研究現(xiàn)狀及企業(yè)研發(fā)過程中應注意的問題進行探討。

1 NAT用于血篩的研究現(xiàn)狀

目前，廣泛應用于臨床血液篩檢的酶免檢測（enzyme immunoassay，EIA）技術，隨著單克隆抗體的應用及靈敏度更高的發(fā)光平臺的建立，靈敏度和特異性在不斷地改進和提高，但每年仍有少數(shù)新發(fā)輸血后肝炎病例報道。除了方法學本身的限制，這些危險主要來自：病毒感染者“窗口期”獻血，病毒變異，免疫靜默感染以及人工操作錯誤。ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）檢測的“窗口期”較長，ELISA技術“窗口期”漏檢是當前影響血液安全性進一步提高的瓶頸。因此，單純ELISA檢測已不能有效地保障血液安全。

NAT檢測是直接檢測病原體核酸的一系列技術的總稱，其靈敏度高，可檢測出標本中極微量的核酸，在病毒感染后數(shù)天即能檢出，可大大縮短“窗口期”。免疫學檢測HBsAg、抗-HIV、抗-HCV的“窗口期”分別為56天、22天、70天[6]。在理論上，NAT技術能夠顯著的縮短病原體檢出的“窗口期”[7]。有研究表明：NAT可將HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短25天（縮短“窗口期”50%）、11天（縮短“窗口期”50%）和59天（縮短“窗口期”89%）[8]。此外，NAT技術的靈敏度和特異性均顯著的高于免疫學方法。盡管NAT技術從理論上并不能完全消除感染的“窗口期”，但通常在病毒核酸轉(zhuǎn)陽之前的血液傳染性很低，可以有效地預防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病。因此，在現(xiàn)有的科學技術條件下，NAT技術的引入可使輸血傳播病毒感染（Transfusion-transmitted viral infection，TTVI）的危險性降至最低。

日本是世界上最早在全國范圍內(nèi)對血液進行HBV、HCV、HIV NAT篩檢的國家，德國和荷蘭從1997年起就開始NAT篩檢的嘗試，英國和法國的部分血站也從2000年起開始了NAT血液篩檢，美國則從1999年3月開始在FDA新藥審核程序下使用不同的試劑進行常規(guī)血液篩檢?？v觀各國運用NAT進行血液篩檢的情況，日本及歐美各國多采用以羅氏公司COBAS AmpliScreen系統(tǒng)及Chiron公司的TMA技術為基礎的檢測方法。各國根據(jù)自身特色，正在對各種不同的技術組合進行評估，目的是尋求一種最適合的NAT技術，既可以保障血液安全，又能保證血液的及時供給，還能做到省時省力。

我國血液制品技術管理部門從2002年開始，先后進行了原料血漿核酸檢測的方法學研究和4萬份取自不同地區(qū)樣本的病原體篩查，并根據(jù)國家食品藥品監(jiān)管機構(gòu)的要求擬定了相關的技術文件[9]。在血液制品原料血漿中開展NAT檢測的相關法規(guī)已在醞釀和討論之中。我國衛(wèi)生部于2000年3月開始在12個省市的15個血液中心進行核酸檢測試點工作，結(jié)果顯示：試點后血液安全性大幅提高，效果非常顯著。因此，衛(wèi)生部、財政部聯(lián)合下發(fā)文件，給予全國68個核酸實驗室投入了1.57億元用于核酸檢測的培訓和相關器械購買，使得血液核酸檢測在更大范圍開展，衛(wèi)生部于2011年8月在哈爾濱召開的全國血液安全工作會議上，要求有條件采用核酸檢測技術的省份盡量采用核酸檢測方法。

2 NAT血篩試劑研發(fā)中應關注的幾個問題

2.1靈敏度 迄今為止正式通過美國FDA認證可用于血液篩檢的試劑僅有2種，即Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/HIV和Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV檢測系統(tǒng)。FDA評判這些試劑是否能用于血液篩檢的標準之一：必須對50cp/mL的病毒核酸的檢出率＞95%。相當一部分國產(chǎn)熒光定量PCR檢測試劑或許能在某些標本上獲得20cp/mL的靈敏度，但一般都很難滿足95%檢出低病毒載量標本的要求。2002年美國AABB年會上甚至有學者提出血液篩檢試劑的靈敏度應該達到（5～6）cp/mL，才能保證不至于因為混合檢測而造成的漏檢，這無疑對血液篩檢NAT試劑提出了更高的要求。

核酸篩查多為混樣方式，由于在“窗口期”血液中HIV和HCV RNA的濃度比較高，這種混合檢測的方法曾經(jīng)，甚至是目前仍然被認為是提高血液安全的可接受的方案。但如果需要進行HBV DNA檢測，為防止低拷貝的HBV病毒陽性血液漏檢，混合樣本數(shù)則不宜過大，應盡可能采用小樣本數(shù)混合檢測，甚至單人份檢測。NAT檢測最初在歐洲普遍流行96人份樣本混合檢測，隨后逐漸更換成48人份、24人份混合[10]。Roche、Chiron新一代NAT檢測系統(tǒng)的標準檢測模式分別為6人份混合檢測和單檢。

2.2特異性 血液篩查對試劑的特異性要求較高，盡管目前應用于臨床診斷的有些國產(chǎn)NAT試劑特異性已經(jīng)很高，但考慮到血液篩查樣本量大，容易因樣本交叉污染、人工操作失誤等因素導致假陽性出現(xiàn)，加上國產(chǎn)試劑、檢測儀器的可靠性及穩(wěn)定性較差，也難以確保檢測結(jié)果的可靠性和準確性。目前，除了提高國產(chǎn)試劑的特異性之外，還必須要建立完善的檢測程序。

2.3內(nèi)標物 目前，我國診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的核酸檢測試劑，多采用外對照作為PCR的質(zhì)控，鮮有采用內(nèi)對照的產(chǎn)品。但作為血源篩查的HIV、HCV RNA檢測試劑，NAT檢測試劑應有內(nèi)標物。每個檢測管都應有內(nèi)標以保證陰性結(jié)果的可靠性，內(nèi)標最好是在樣品處理時即加入，這樣能對樣品處理至核酸擴增檢測全過程進行監(jiān)控；內(nèi)標最好為RNA，便于對檢測過程中是否出現(xiàn)模板RNA降解問題進行監(jiān)控。

2.4全自動化操作 NAT操作步驟較復雜，影響因素較多，且對操作人員的技能要求較高。采用全自動核酸提取、擴增檢測，能縮短檢測時間，提高檢測效率，便于質(zhì)控，同時也有利于進行大樣本量的篩查。Roche新一代檢測系統(tǒng)COBAS S201 MPX System實現(xiàn)了在同一反應管中進行HIV/HCV/HBV 3項聯(lián)合檢測，實現(xiàn)了混樣/加樣、核酸提取、PCR擴增/檢測的模塊自動化；Chiron公司新一代檢測體系PROCLEIX TIGRIS ULTRIO System在對單個標本進行篩查時，可以在單一的全自動設備（TIGRIS）上進行，此設備能完成樣品抽提、擴增和檢測全部工作。目前，我國核酸提取設備多為半自動化操作，提取效率較差，尚未在國內(nèi)采供血機構(gòu)廣泛應用。因此，應該對核酸提取、擴增檢測的整個流程進行優(yōu)化，縮短檢測時間，提高檢測效率，建立一整套適合我國國情的血液核酸自動化提取、擴增檢測系統(tǒng)。

我國現(xiàn)階段除了引進成熟的NAT血篩技術外，還應提高國產(chǎn)核酸檢測試劑的質(zhì)量和自動化，完善國產(chǎn)血液NAT檢測系統(tǒng)。這樣不但可降低相應的檢測費用，同時還更有利于新技術在國內(nèi)的推廣應用，進一步提高我國血液安全水平?？傊覈赜蜻|闊，經(jīng)濟發(fā)展水平、工作條件等相差較大，以何種具體形式開展血液NAT檢測是一個需要深入探討的問題。