周 蕊，李曉東，潘 超

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

促熟干酪的非發(fā)酵劑乳酸菌篩選及其對干酪漿模型蛋白質(zhì)降解的研究

周 蕊，李曉東*，潘 超

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜中分離篩選促進干酪成熟的非發(fā)酵劑乳酸菌，并研究其對干酪漿蛋白質(zhì)降解的影響。應用ROGOSA瓊脂從東北農(nóng)家酸菜中分離菌株，采用多元統(tǒng)計分析法進行復篩，通過16S rDNA基因序列分析鑒定篩選菌株，最后研究篩選菌株對干酪漿蛋白水解特性的影響。結(jié)果表明：從酸菜中篩選出一株可以促進干酪成熟的非發(fā)酵劑乳酸菌S-1，經(jīng)16S rDNA基因序列分析鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ)，此菌株產(chǎn)酸能力低，具有較高的自溶度與氨肽酶活力，在干酪漿模型成熟過程中表現(xiàn)出較強的蛋白水解能力。

干酪；促熟；酸菜；非發(fā)酵劑乳酸菌；篩選；鑒定；蛋白質(zhì)降解

干酪成熟是一個緩慢且昂貴的過程，因此干酪的促熟受到人們的普遍關(guān)注。促熟發(fā)酵劑是經(jīng)過精細篩選并添加至新鮮干酪中可以加快干酪成熟的一類微生物[1]。非發(fā)酵劑乳酸菌(nonstarter lactic acid bacteria，NSLAB)可作為促熟發(fā)酵劑加速干酪成熟，逐漸成為干酪促熟方法的研究熱點。NSLAB在干酪成熟過程中通過直接代謝或釋放各種酶到干酪結(jié)構(gòu)中，對干酪質(zhì)構(gòu)的變化和風味的形成有著重要貢獻[2]。目前，一些研究表明NSLAB有利于加速干酪成熟并提升風味，但也有研究證明某些菌株能夠產(chǎn)生消極影響。因此，篩選適宜的NSLAB就顯得尤為重要。

由于干酪成熟時間長，研究人員建立干酪漿模型快速準確評價添加菌株對干酪成熟的影響。干酪漿模型中水分含量較高并采用較高的成熟溫度(30～32℃)，從而起到快速成熟的效果，研究者將其作為一種快速可靠的工具來評價添加物對干酪成熟的影響[3]。

在國外，原料乳與奶酪是篩選NSLAB的普遍來源，而從非乳來源篩菌的研究是有限的[4]。中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物資源豐富，從中篩選具備促熟發(fā)酵劑特征的NSLAB具有一定的可行性。本實驗從酸菜中初步篩選革蘭氏陽性無芽孢桿菌，由于菌株的生物學特性具有相關(guān)性，所以本課題組以產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力為指標，通過多元統(tǒng)計方法復篩出綜合性能較強的非發(fā)酵劑乳酸菌菌株，利用干酪漿模型快速評價菌株的蛋白降解能力，為獲得優(yōu)良的促熟發(fā)酵劑提供菌源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室自制自然發(fā)酵酸菜，腌制好的樣品裝入滅菌玻璃瓶中，密封。

細菌基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；L-亮氨酸對硝基苯胺 美國Sigma公司；16S rDNA序列擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

BS203光學顯微鏡 重慶光學電子設(shè)備有限責任公司；UV-6000pc紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機 無錫建議實驗器材有限公司；PHS-3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 非發(fā)酵劑乳酸菌的初篩

將酸菜的菜葉和汁水均質(zhì)，勻漿過濾后以pH6.8的PBS緩沖液梯度稀釋，吸取適宜稀釋度溶液100μL傾注于無菌培養(yǎng)皿，與調(diào)整的ROGOSA瓊脂培養(yǎng)基(4g/100mL NaCl，pH5.0，近似干酪成熟環(huán)境)混勻，30℃厭氧條件下培養(yǎng)36～72h。挑取典型菌落轉(zhuǎn)接到MRS平板純化，鏡檢選取革蘭氏陽性無芽孢桿菌轉(zhuǎn)接入MRS液體培養(yǎng)基增菌，獲得乳桿菌菌株并保存。

1.3.2 非發(fā)酵劑乳酸菌的復篩

菌株的產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力具有相關(guān)性[5]，以這些生物學特性為指標采用多元統(tǒng)計法進行復篩。

1.3.2.1 產(chǎn)酸能力測定

菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24h，連續(xù)活化兩代，調(diào)整菌體懸浮液初始OD650nm為1.0，以體積分數(shù)2%的接種量接入10g/100mL滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24h，接菌后相隔24h測定pH值，以ΔpH表示菌株的產(chǎn)酸能力[6]。

1.3.2.2 自溶度測定

菌株活化兩代后，冷凍離心(10000×g，10min，4℃)，得到的菌體懸浮于0.2mmol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，調(diào)整初始OD650nm為0.6～0.8，置于30℃培養(yǎng)箱，間隔24h后測定OD650nm的變化[7]。

1.3.2.3 氨肽酶活力測定[8]

采用LNA法：取3mL Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7.8)、底物Lysine-p-nitroanilide(16.4mmol/L)和稀釋一定倍數(shù)的菌液混勻在37℃保溫10min，0.5mL、30%乙酸終止反應，在波長405nm處比色測定酶活力。空白對照管不放入菌液。酶活力單位定義為：37℃時，每分鐘生成1μmol對硝基苯胺為一個酶活力單位，用U表示。

1.3.2.4 菌株乳蛋白水解能力測定

參考Church等[9]的鄰苯二甲醛(OPA)方法繪制0.1～3mmol/L甘氨酸標準曲線，并且測定菌株乳蛋白水解能力。OPA現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。菌株以1%接種量接種于12g/100mL脫脂乳中，于37℃培養(yǎng)24h，以未接菌的10g/100mL脫脂乳作為空白。5mL樣品、1mL重蒸餾水和1mL 0.75mol/L三氯乙酸混勻，靜置10min，3000r/min離心5min，將1mL上清液與3mL OPA試劑混勻，反應2min，于340nm波長處測吸光度。對應標準曲線得出蛋白水解活性相當于甘氨酸的量，以A340nm作為OPA指數(shù)也可直接對比。酶活力單位定義：在37℃，每分鐘分解牛奶蛋白產(chǎn)生1μmol甘氨酸所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。

式中：K為酶液稀釋倍數(shù)；W為生成的甘氨酸量/μmol； V為反應酶液體積/mL；t為反應時間/min。

1.3.2.5 數(shù)據(jù)分析

由于產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力彼此有一定的相關(guān)性，因而所得的統(tǒng)計數(shù)據(jù)反映的信息在一定程度上有重疊。為了全面、系統(tǒng)地分析問題，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件中主成分分析法把多指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標去解釋大部分資料中的變異。因此，利用主成分分析法對產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力4個指標進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 菌屬鑒定

采用16S rDNA基因測序法鑒定菌株。PCR擴增引物F27 (5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)及R1541(5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇)。PCR反應條件：94℃、5min；94℃、1min，58℃、1min，72℃、2min，30個循環(huán)；最后72℃、10min。產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司純化后測序。利用Blast軟件，將測序結(jié)果輸入GenBank，確定目的基因的同源性[10]。

1.3.4 干酪凝乳的制作工藝流程

原料乳→殺菌(65℃，30min)→冷卻(30℃)→接菌種→攪拌→靜置發(fā)酵→添加凝乳酶→攪拌→凝乳→切割→熱燙排乳清→凝塊堆砌(至排出乳清pH值降至5.5)→切塊即得干酪凝乳

1.3.5 干酪漿模型的制作

取100g上述干酪凝乳裝入無菌攪打機中，加入50mL 5g/100mL的滅菌氯化鈉溶液(對照組)或47mL 5g/100mL的滅菌氯化鈉溶液和3mL(接菌量為3%)的菌株脫脂乳(實驗組)，在攪打機中攪打成漿狀。對照組與實驗組在30℃厭氧箱中培養(yǎng)[11]，分別于0、2、5、7、10d取樣分析。上述操作均在無菌操作室內(nèi)進行，制作過程中所用的攪拌器及切割刀等所用器具使用前蒸汽滅菌(121℃，60min)。

1.3.6 菌株在干酪漿模型成熟過程中蛋白質(zhì)降解的測定

1.3.6.1 pH4.6可溶性氮含量測定

采用Agboola等[12]的方法。

1.3.6.2 三氯乙酸可溶性氮(TCA-N)含量測定

取pH4.6可溶性氮上清液16mL，加入4mL 12% TCA，靜置1h，用Whatman 1#濾紙過濾。上清液10mL進行凱氏微量定氮，以占干酪總氮量的百分數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 非發(fā)酵劑乳酸菌的初篩

挑取典型菌落接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，劃線分離得到24株純培養(yǎng)菌株。顯微鏡觀察后保留了1 8株革蘭氏陽性無芽孢桿菌，將分離菌株編號為S-1～S-1 8。

2.2 非發(fā)酵劑乳酸菌的復篩

2.2.1 產(chǎn)酸能力比較

NSLAB是干酪微生物中的一種獨特菌群，在干酪生產(chǎn)過程中對產(chǎn)酸、凝乳貢獻不大[13]。NSLAB定義為在干酪中發(fā)現(xiàn)的不是發(fā)酵劑成分的乳酸菌，也就是說，在干酪生產(chǎn)過程中，對于酸的產(chǎn)生不起作用，應篩選產(chǎn)酸能力較低或不產(chǎn)酸的菌株。

由表1可知，S-1菌產(chǎn)酸能力最弱，ΔpH為0.63，S-2、S-8、S-9菌株產(chǎn)酸能力較高，ΔpH分別為1.32、1.25和1.16，其余各菌株產(chǎn)酸能力約為1。

表1 18株菌株的ΔpH、自溶度、蛋白水解能力與氨肽酶活力的測定結(jié)果Table1 Properties of 18 strains isolated from

表1 18株菌株的ΔpH、自溶度、蛋白水解能力與氨肽酶活力的測定結(jié)果Table1 Properties of 18 strains isolated from

注：同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)。

菌株編號ΔpH(24h)自溶度/%蛋白水解能力/(U/mL)氨肽酶活力/(U/mL) S-10.63±0.101d31.64±0.814a2.553±0.009e14.767±0.153aS-21.32±0.301a27.23±0.797bc3.091±0.059a2.733±0.208fS-31.09±0.045bc26.76±0.661bc2.089±0.003i4.567±0.551dS-41.07±0.047bc27.23±0.359bc1.929±0.006j3.433±0.153efS-51.08±0.056bc26.93±0.42bc2.172±0.01h1.600±0.265gS-60.99±0.026c31.03±0.551a2.072±0.048i6.700±0.625bS-71.01±0.036c21.99±0.496d1.912±0.009j4.000±0.500deS-81.25±0.062ab28.26±0.427b2.821±0.024b4.200±0.265deS-91.16±0.07b24.31±0.498cd2.435±0.050f4.633±0.322dS-101.01±0.121c29.74±0.1ab1.856±0.007k4.067±0.503deS-111.07±0.07bc27.68±0.666bc1.804±0.052k3.700±0.200eS-121.07±0.01bc25.62±0.776bc2.759±0.039c5.733±0.808cS-131.06±0.044bc20.29±0.385d2.094±0.034i5.400±0.458cS-140.96±0.036c25.47±0.986c2.467±0.003f6.567±0.322bS-151.01±0.03c23.71±0.184cd1.499±0.011l5.033±0.252cdS-161.03±0.011bc14.85±0.346e1.921±0.026j2.833±0.208fS-171.06±0.031bc26.22±0.683bc2.333±0.052g4.533±0.306dS-181.06±0.04bc23.42±0.21cd2.69±0.003d5.467±0.252c

2.2.2 自溶度結(jié)果分析

干酪成熟過程中，非發(fā)酵劑乳酸菌細胞的快速自溶可以促進胞內(nèi)肽酶的及早釋放并能在干酪中保持活性，使得游離氨基酸增多且降低苦味形成[14-15]。由表1可以看出，18株菌株的自溶度范圍(14.85%～31.64%)分布較廣，其中90%的菌株的自溶度值在20.29%～29.74%之間，S-1號與S-6號菌株的自溶度達到30%以上，分別為31.64%和31.03%。

2.2.3 氨肽酶活性結(jié)果分析

研究發(fā)現(xiàn)氨肽酶具有降解疏水性氨基酸和降低苦味的潛力，高肽酶活力特別是低產(chǎn)酸能力的菌種的添加對干酪促熟具有非常大的作用[16]。這一點表明NSLAB的胞內(nèi)酶活力，尤其是高氨肽酶活力的重要性。

由表1可知，S-1號菌株的氨肽酶活性顯著高于其他菌株，為14.767U；S-6號與S-14號菌株的氨肽酶活力相當，低于S-1號菌株，分別為6.7U和6.567U，其余菌株的氨肽酶活力值相差較大，從1.600U到5.733U之間變化。

2.2.4 菌株乳蛋白水解情況分析

由表1可知，不同菌株之間蛋白水解能力差異顯著(P＜0.05)。S-2菌株的蛋白水解能力較強，為3.091U/mL；S-8號和S-12號菌株蛋白水解能力次之，分別為2.821U/mL和2.759U/mL。

蛋白質(zhì)水解的速率很大程度上決定著干酪成熟期的長短，加快干酪蛋白質(zhì)水解速率可以縮短成熟時間。非發(fā)酵劑乳酸菌中的酶類可以水解乳中蛋白質(zhì)，將多肽釋放于培養(yǎng)基中，再經(jīng)肽酶進一步水解為更小的肽類或氨基酸[17-18]。但是，強蛋白水解能力能夠引起苦味肽與不良物質(zhì)的生成，使干酪質(zhì)地變軟。

2.2.5 菌株生物學特性的多元統(tǒng)計篩選

以產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活性和蛋白水解能力為篩選指標應用主成分分析法對18株菌株進行復篩，結(jié)果如表2所示。

表2 方差的主成分提取分析Table2 Variance analysis for major properties of 18 strains isolated from

表2 方差的主成分提取分析Table2 Variance analysis for major properties of 18 strains isolated from

相關(guān)矩陣的特征值提取因子載荷的平方和成分各成分特各成分方差累計百分各因子特各因子的累計貢獻征值百分比/%比/%征值貢獻率/%率/% 11.96649.15949.1591.96649.15949.159 21.27631.90381.0611.27631.90381.061 30.68917.21498.275 40.0691.725100.000

由表2可知，前兩個因子已經(jīng)可以解釋81.06%的方差。利用載荷矩陣與特性向量之間的關(guān)系，能夠計算出前兩個特征向量，由此得到兩個主成分具體表達式為：Y1＝0.547X1＋0.952X2＋0.061X3-0.87X4；Y2＝0.512X1＋0.055X2＋0.901X3＋0.4454X4。式中，X1、X2、X3和X4分別為菌株的產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活性和蛋白水解能力。根據(jù)主成分分析計算出每個菌株的主成分值，最后利用各特征值的方差貢獻率做權(quán)重得到18株菌株的綜合得分，結(jié)果見表3。

表3 18株菌株的綜合得分以及排名結(jié)果Table3 Comprehensive evaluation and ranking of 18 strains isolated from

表3 18株菌株的綜合得分以及排名結(jié)果Table3 Comprehensive evaluation and ranking of 18 strains isolated from

菌株編號Y1Y2綜合評價排名S-112.1617216.6263513.9191 S-29.95902115.3228112.070215 S-39.88105114.2219511.589639 S-410.0632514.3003311.730967 S-59.94107314.3603511.68058 S-611.6229216.1014213.385662 S-78.05998811.885629.56575816 S-810.4006915.5494512.427244 S-98.90088713.4155610.6778613 S-1011.0833115.3550912.764683 S-1110.2336514.4024311.874486 S-129.48976514.2334611.3568811 S-137.38282711.28078.91702417 S-149.48996113.886811.2205612 S-158.72396612.3370910.1460915 S-165.2600388.6677916.60132918 S-179.70306614.1566711.4560110 S-188.63374613.178110.422414

由表3可知，S-1菌株的綜合評價最高，該菌的產(chǎn)酸能力低、自溶度及氨肽酶活性高，蛋白水解能力較高。在一定范圍內(nèi)菌株自溶酶的活性隨著環(huán)境中干酪的pH值逐漸升高而增大，所以，當干酪體系中酸度較弱時，自溶特性強的菌株快速自溶，釋放胞內(nèi)蛋白酶、氨肽酶等，酶活性較高的菌株快速水解蛋白質(zhì)，加快干酪促熟。因此，實驗選取S-1菌株作為促熟發(fā)酵劑。

2.3 16S rDNA基因序列分析

圖1 菌株S-1 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR-amplified fragments from strain S-1

圖1為菌株S-1的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，GenBank登錄號為CP002222，Blast比對結(jié)果顯示，菌株S-1與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ)同源性達到99%。因此，菌株S-1鑒定為植物乳桿菌。

2.4 菌株S-1對可溶性氮含量的影響

pH4.6可溶性氮含量的高低表明蛋白質(zhì)水解程度的高低，它是干酪成熟程度的一種標志[19]。pH4.6可溶性氮主要分離出小肽和中肽。由圖2可知，在成熟過程中添加菌株S-1的實驗組與對照組之間pH4.6可溶性氮含量無顯著性差異(P＞0.05)，說明菌株S-1對酪蛋白的初級水解作用無影響。

圖2 干酪漿成熟過程中pH4.6可溶性氮含量變化Fig.2 Change in pH 4.6 soluble nitrogen content during cheese slurry ripening in the presence of strain S-1

2.5 菌株S-1對 TCA-N可溶性氮含量的影響

12% TCA反映蛋白質(zhì)降解的深度，可以更好的作為干酪成熟的指標。TCA-N主要分離出小分子肽和游離氨基酸[20]。由圖3可知，在成熟過程中添加菌株S-1的實驗組TCA-N濃度高于對照組(P＜0.05)，表明菌株S-1在成熟過程中自溶裂解釋放的胞內(nèi)肽酶加速了體系中小肽和游離氨基酸的產(chǎn)生，對干酪的促熟起到一定作用。

圖3 干酪漿成熟過程中12%TCA-N含量變化Fig.3 Change in TCA-N content during cheese slurry ripening in the presence of strain S-1

3 結(jié) 論

從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜中篩選出一株非發(fā)酵劑乳酸菌菌株S-1，經(jīng)16S rDNA基因序列分析鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ)，該菌株能夠在干酪成熟環(huán)境中生長，其產(chǎn)酸能力低、自溶度以及氨肽酶活性較高；在干酪漿模型中水解蛋白能力較強，適宜作為優(yōu)良的促熟發(fā)酵劑。

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Isolation of a Strain of Non-starter Lactic Acid Bacteria Accelerating Cheese Ripening and Its Effect on Cheddar Cheese Slurry Proteolysis

ZHOU Rui，LI Xiao-dong*，PAN Chao
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

A strain of non-starter lactic acid bacteria capable of accelerating cheese ripening were screened and isolated and its effect on cheddar cheese slurry proteolysis during ripening was also explored. Rogosa agar medium was used for primary strain isolation from Chinese northeastern traditional fermented food, and the isolates obtained were screened further by multivariate statistical analysis. Strain identification was conducted by 16S rDNA gene sequencing and Blast searches against the public database. The results showed that a non-starter lactic acid bacterium was successfully isolated and named as S-1. The strain was identified as Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III. Moreover, the strain displayed high aminopeptidase activity and autolytic capacity although it had low acid-producing capacity. Furthermore, the strain revealed high proteolytic capacity during cheese slurry ripening.

cheese；ripening-accelerating effect；Suancai；non-starter lactic acid bacteria；screening；identification；proteolysis

TS252.53；TS201.3

A

1002-6630(2012)01-0131-05

2011-02-16

2010年度教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”資助項目(IRT0959)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD09B00)

周蕊(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為乳品科學與技術(shù)。E-mail：emmazhou1985@163.com

*通信作者：李曉東(1968—)，男，教授，博士，研究方向為乳品科學與技術(shù)。E-mail：hrblxd@163.com