余 芳，李德龍，張 波，高艷玲，張少輝,2,*

( 1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全中心，上海 200240)

牛初乳中富脯氨酸多肽的純化與鑒定

余 芳1，李德龍1，張 波1，高艷玲1，張少輝1,2,*

( 1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全中心，上海 200240)

以牛初乳為原料，提取分離具有生物活性的富脯氨酸多肽(proline-rich polypeptides，PRP)，并從氨基酸組成、分子質(zhì)量大小和反相色譜方面對(duì)其進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果表明：分離所得多肽脯氨酸含量高達(dá)20%；SDS-PAGE顯示主成分分子質(zhì)量分布范圍在5～25kD；反相色譜主要譜峰在乙腈體積分?jǐn)?shù)37%～45%處洗脫，在這一體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)可得到純度高達(dá)96.7%的富脯氨酸多肽。

富脯氨酸多肽；分子質(zhì)量；氨基酸組成；反相色譜

哺乳動(dòng)物產(chǎn)后2～3d內(nèi)所分泌的乳汁統(tǒng)稱(chēng)為初乳[1]。牛初乳作為一種新型功能食品的開(kāi)發(fā)來(lái)源，不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且也富集了一些具有生物活性的免疫因子和生長(zhǎng)因子，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子等。經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明這類(lèi)物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等一系列生理活性功能。因而牛初乳作為動(dòng)物和人類(lèi)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抵抗疾病的功能，可作為新一代功能性食品資源庫(kù)在保健食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用[2-3]。

富脯氨酸多肽(proline-rich polypeptides，PRP)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種來(lái)源于牛初乳的多肽類(lèi)活性成分。PRP的發(fā)現(xiàn)源于1974年，波蘭科學(xué)家Janusz等[4]在采用凝膠過(guò)濾法純化羊初乳IgG2時(shí)，伴隨IgG2同時(shí)存在著另一種成分，一種不能同時(shí)被抗免疫球蛋白的抗血清所沉淀的物質(zhì)PRP。之后的研究表明PRP具有特殊的結(jié)構(gòu)及特性：富含大量的脯氨酸和疏水性氨基酸；在4℃條件下可溶于水，室溫下發(fā)生可逆性沉淀；它可以調(diào)節(jié)人體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)皮膚脈管的滲透性[5]，是一種免疫活性物質(zhì)。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)這種成分對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)具有很好的預(yù)防及治療作用[6-7]，因而將這種活性成分從牛初乳中分離出來(lái)，并對(duì)其某些物理化學(xué)性質(zhì)作客觀的鑒定評(píng)價(jià)，對(duì)今后生物活性功能的研究和牛初乳功能性食品的應(yīng)用都具有重要意義。

在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，隨著人口老齡化的增加，AD的發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)。由此，英美國(guó)家對(duì)于初乳來(lái)源的PRP功能的研究亦開(kāi)始漸熱。他們研究的內(nèi)容主要針對(duì)PRP糜蛋白酶水解物某些片段的生物活性功能，尤其是在抗氧化、抗衰老、抗神經(jīng)退行性病變的功效，而對(duì)于天然狀態(tài)PRP的純化鑒定相對(duì)較少。在國(guó)內(nèi)更是未見(jiàn)PRP的相關(guān)報(bào)道。因此本研究借助有機(jī)溶劑提取、鹽析、透析等一系列蛋白質(zhì)純化的方法從初乳中分離出PRP，并通過(guò)分子質(zhì)量大小、氨基酸組成和反向色譜分析進(jìn)行化學(xué)鑒定，以期更全面地了解這種活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳為乳牛產(chǎn)后第1天的初乳，由蒙牛丹陽(yáng)現(xiàn)代牧場(chǎng)饋贈(zèng)。

SDS、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；Tris、甘氨酸 美國(guó)Sigma公司；乙腈 美國(guó)Fisher公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

A..KTA Purifier 10層析系統(tǒng)、Source 5RPC ST 4.6/150反相柱 美國(guó)GE Healthcare公司；GL-22M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；Mini-PROTEAN Tetra System 美國(guó)Bio-Rad公司；0.22μm 超濾膜 美國(guó)Millipore公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一型儀器廠；透析袋MD34 英國(guó)Whatman公司；BS124s型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；CM-230型摩爾超凈水機(jī) 上海摩勒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PRP的提取

按兩步純化(乙醇提取，硫酸銨沉淀)法提取PRP[8-9]：室溫條件下解凍牛初乳，8000×g離心20min脫脂，在低溫條件下加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇抽提，邊加入邊攪拌，酪蛋白等雜蛋白不斷析出，12000×g離心，取上層有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，蒸發(fā)溫度設(shè)為30℃，待體積恢復(fù)至原脫脂乳體積之后，離心去除不溶性沉淀。取PRP水相，以50%飽和硫酸銨鹽析，沉淀PRP以少量超純水溶解，隔夜透析，透析液凍干后保存于-20℃?zhèn)溆?。以上所有步驟未特別標(biāo)明的均在4℃條件下操作。

1.3.2 PRP分子質(zhì)量的檢測(cè)

根據(jù)表1制備分離膠及濃縮膠。樣品與2×樣品緩沖液以1:1體積混合稀釋后，沸水中加熱5min，室溫條件下冷卻，然后上樣進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。待指示劑距凝膠下沿0.2～0.5cm處停止電泳，染色30min后開(kāi)始脫色。計(jì)算電泳遷移率(Rf)。

測(cè)定小分子多肽的電泳遷移率(Rf)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算被測(cè)樣品的分子質(zhì)量：以Marker條帶的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，經(jīng)線性回歸計(jì)算，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 PRP氨基酸組成分析

酸水解法水解上述純化后的PRP[10]：稱(chēng)取2mg放入玻璃管中，加入2mL 6mol/L HCl，充氮?dú)?min，封管。將玻璃管放在110℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24h。水解結(jié)束后冷卻至室溫，定容至10mL，過(guò)濾，取1mL濾液置真空干燥器中55℃左右抽真空干燥，加入純水 1mL溶解。加入0.1mmol/L NaOH，調(diào)節(jié)pH值至1.7～2.2，0.22μm濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)入樣品瓶待測(cè)。用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸組成的分析。

1.3.4 PRP的反相色譜分析

1.3.4.1 色譜工作條件

流動(dòng)相A液：2% 乙腈水溶液(含0.02%三氟乙酸)；流動(dòng)相B液：75%乙腈；流速1mL/min；進(jìn)樣量1mL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)228nm。流動(dòng)相 A、B 液需超聲脫氣后使用。

1.3.4.2 反相色譜分析

稱(chēng)取適量的PRP凍干粉，以少量0.01%二甲基亞砜(DMSO)助溶，加入A液調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度，使質(zhì)量濃度在0.5～1mg/mL左右，0.22μm濾膜過(guò)濾后上樣。經(jīng)Source 5RPC ST 4.6/150反相層析柱進(jìn)行線性梯度洗脫。

表1 SDS-PAGE電泳膠配方Table1 Recipe for SDS-PAGE gel

2 結(jié)果與分析

2.1 PRP的分子質(zhì)量

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定常規(guī)的方法包括SDS-PAGE和凝膠色譜技術(shù)[11]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，在查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度以及純化效果的同時(shí)，可以預(yù)估PRP的分子質(zhì)量。

圖1 PRP混合肽的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE pattern of PRP

SDS-PAGE能夠較好地顯示標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶(圖1)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子質(zhì)量在15～200kD時(shí)，電泳遷移率與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程：

1gMr=K-bRf

式中：Mr為蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量；K為常數(shù)；b為斜率；Rf為相對(duì)遷移率。在條件一定時(shí)，b和K均為常數(shù)。

根據(jù)電泳結(jié)果，對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(y)和分離膠中的遷移率(χ)進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為y＝-1.3276χ＋2.0909，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9741，具有良好的線性關(guān)系。

PRP混合肽經(jīng)SDS-PAGE電泳，根據(jù)分子質(zhì)量的差異，不同的多肽成分被分開(kāi)。PRP多肽片段的分子質(zhì)量分布在5～25kD范圍內(nèi)，且不同多肽之間豐度存在差異，較為清晰的有4個(gè)條帶。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，前2個(gè)條帶中對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量分別為24.52、19.47kD；分子質(zhì)量較小的多肽也有兩條且較為接近，分布在5～14.4kD之間，約為10kD。

2.2 PRP的氨基酸組成

本研究將透析之后的PRP分成兩部分：一部分為可溶性的PRP，另一部分在透析過(guò)程中析出，以沉淀形式存在的物質(zhì)。為了研究沉淀物質(zhì)是否屬于變性的PRP，本研究對(duì)這兩部分都進(jìn)行了氨基酸組成的分析。

表2 PRP的氨基酸分析表Table2 Amino acid composition of PRP

由表2可知，沉淀與上清液部分谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸的量均明顯高于其他氨基酸，其中脯氨酸所占的比率分別為19.2%、20.5%。單純從氨基酸組成來(lái)看，上清液中谷氨酸、纈氨酸、脯氨酸均較沉淀有增加，視為PRP混合肽的特征氨基酸，說(shuō)明沉淀中包含變性的PRR混合肽。另外，氨基酸分析結(jié)果顯示PRP中脯氨酸所占的比例約20%，疏水性氨基酸40%，酸性氨基酸21%。由于脯氨酸是一種環(huán)狀的亞氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的常見(jiàn)20種氨基酸中唯一的亞氨基酸，在肽鏈中有特殊的作用，易于形成順式的肽鍵，不利于α螺旋的形成。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，由于脯氨酸的引入導(dǎo)致多肽和蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，相應(yīng)地對(duì)應(yīng)著一定的生物學(xué)功能[12]。因此，PRP這種氨基酸組成提示PRP結(jié)構(gòu)與生物活性之間可能存在關(guān)系。

2.3 PRP的純化與反相色譜

采用反相色譜(RPC)方法，使用C18反相柱和梯度體積分?jǐn)?shù)乙腈溶液對(duì)PRP進(jìn)行了純化。

圖2 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的PRP吸收峰Fig.2 Absorption spectra of PRP under different detection wavelengths

反相色譜分析結(jié)果顯示，在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下，PRP在228nm處信號(hào)較強(qiáng)，且基線漂移不顯著，選擇228nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)(圖2)。228nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，圖譜顯示提純的PRP各不同多肽之間疏水性的差異不明顯，50%～60% B液時(shí)PRP混合多肽可以洗脫下來(lái)，換算后即為37%～45%乙腈(圖3)。相關(guān)研究認(rèn)為，這一體積分?jǐn)?shù)洗脫出來(lái)的PRP多肽是Colostrinin的主成分，決定了產(chǎn)品的主要活性功能[13]。Unicorn軟件積分得到的洗脫峰的總面積為200.70，35～40min內(nèi)的目標(biāo)峰面積為194.12，純度高達(dá)96.7%。

圖3 PRP反相色譜圖Fig.3 RP-HPLC profile of PRP

RPC與其他色譜方法相比具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果表明采用RPC方法，使用合適的反相柱和洗脫液能夠?qū)RP類(lèi)低分子質(zhì)量蛋白進(jìn)行有效的分離純化。相關(guān)文獻(xiàn)也表明與較大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離相比，RPC更適用于分子質(zhì)量小、空間折疊相對(duì)簡(jiǎn)單的多肽。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的立體構(gòu)型及構(gòu)象復(fù)雜，與流動(dòng)相、固定相及樣品中的其他成分之間往往存在多種復(fù)雜的相互作用，使蛋白變性失活。但作為一種分析手段，卻能夠給出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及疏水性等信息[14]。

3 結(jié) 論

本研究借助有機(jī)溶劑提取、鹽析、透析等一系列蛋白質(zhì)純化的方法，從牛初乳中分離并純化了PRP混合性多肽，以分子質(zhì)量大小，氨基酸組成和反相色譜差異為指標(biāo)鑒定了PRP混合多肽的物理化學(xué)特性。PRP不是單一肽，而是一種混合肽，組成較為復(fù)雜，SDS-PAGE顯示的分子質(zhì)量分布在5～25kD左右，豐度較高的多肽有4條，分子質(zhì)量較大的為24.52、19.47kD。PRP的氨基酸組成較為特殊，脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸的含量較高，其中脯氨酸約20%，疏水性氨基酸40%，酸性氨基酸21%。反相圖譜顯示PRP不同多肽之間結(jié)構(gòu)差異不明顯，采用C18反相柱和體積分?jǐn)?shù)為37%～45%的乙腈洗脫可得到純度96.7%的PRP產(chǎn)物。

初乳功能性食品的開(kāi)發(fā)研究具有廣闊的應(yīng)用前景。PRP作為初乳來(lái)源的功能性成分，沒(méi)有物種特異性，對(duì)包括人在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物都能起作用，可以廣泛應(yīng)用在保健食品行業(yè)。目前，還不能達(dá)到逐個(gè)分離PRP單一多肽的要求，關(guān)于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的描述尚停留在混合物層面上。單一多肽的分離鑒定、相應(yīng)生物學(xué)功能的研究以及作用機(jī)制是未來(lái)研究的方向之一。

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Purification and Identification of Proline-rich Polypeptides from Bovine Colostrum

YU Fang1，LI De-long1，ZHANG Bo1，GAO Yan-ling1，ZHANG Shao-hui1,2,*
( 1. School of Agriculture and Biology, Shanghai JiaoTong University, Shanghai 200240, China；2. Luh Bor. S. Research Center for Food Safety, Shanghai JiaoTong University, Shanghai 200240, China)

Bovine colostrum was extracted to obtain bioactive proline-rich polypeptides (PRP). The molecular weight and amino acid composition of PRP were analyzed by means of SDS-PAGE and an automated amino acid analyzer, respectively. Reversedphase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was employed to purify PRP. The results showed that the proline content in PRP was as high as 20%. The molecular weights of principal components were in the range of 5-25 kD as determined by SDS-PAGE. RP-HPLC showed that major spectral peaks were eluted by 37%-45% acetonitrile. As a result, PRP with a purity of 96.7% was obtained.

proline-rich polypeptide；molecular weight；amino acid composition；reversed-phase chromatography

TS252.1

A

1002-6630(2012)01-0077-04

2011-01-23

余芳(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：yuflili@sjtu.edu.cn

*通信作者：張少輝(1965—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：shaohuizhang@sjtu.edu.cn