曹新梅，張岱權(quán)，王 栩，任德蓮，劉代玉

(1瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000;2瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

HER2基因是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體。該受體數(shù)量、結(jié)構(gòu)的異常變化?？蓪?dǎo)致細(xì)胞生長異常及癌腫的形成。有文獻(xiàn)報(bào)道［1］，1/3以上的非小細(xì)胞肺癌存在HER2蛋白過度表達(dá)。2010年7月～2011年12月，我們觀察了靶向HER2基因的siRNA聯(lián)合卡鉑對肺腺癌A549細(xì)胞的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細(xì)胞株(由瀘州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。RPMI 1640(美國Invitrogen公司)、小牛血清(天津海洋生物)。焦碳酸二乙酯(DEPC)(美國Sigma公司)，LIPOFECTAMINE 2000 Reagent、Trizol(美國Invitrogen公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TOYOBO公司)，卡鉑(齊魯制藥有限公司)，SABC免疫組化試劑盒(丹麥DAKO公司)，AnnexinⅤ-FITC Kit凋亡試劑盒(凱基公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)及分組 肺腺癌A549細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期肺腺癌A549細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞融合40% ～60%時(shí)，分為6組進(jìn)行轉(zhuǎn)染:2621組、1724組、1491組(數(shù)字為合成3對HER2 siRNA的代碼)、陰性對照組、GAPDH陽性對照組和空白組，每組3個復(fù)孔。以LIPOFECTAMINE 2000 Reagent為轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測HER2 mRNA水平 轉(zhuǎn)染24 h后，用Trizol試劑抽提每組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s，95℃變性10 s，60℃退火15 s，40個循環(huán)。運(yùn)用 MyiQTMOptical Module的電腦軟件分析系統(tǒng)對實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 免疫組化檢測肺腺癌A549細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)水平 將經(jīng)多聚賴氨酸包被處理過的玻片放入6孔板中，接種肺腺癌A549細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，取出玻片，用PBS沖洗2次，在中性甲醛中固定，SABC常規(guī)免疫組化方法檢測HER2蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分組:①空白組;②陰性siRNA組;③陰性siRNA+卡鉑(40或60 mg/L)組;④2621組;⑤2621+卡鉑(40或60 mg/L)組;⑥1724組;⑦1724+卡鉑(40或60 mg/ L)組;⑧卡鉑(40或60 mg/L)組。收集每組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入Binding Buffer 500 μL重懸細(xì)胞;置入5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻;室溫、避光反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以s表示，多樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HER2 mRNA及蛋白水平比較 見表1。

表1 各組HER2 mRNA及蛋白水平比較(s)

表1 各組HER2 mRNA及蛋白水平比較(s)

注:與2621組、1724組比較，*P＜0.05

蛋白2621組組別 n HER2 mRNA HER2 3 1.00±0.00 9.93±2.03 1724組 3 1.48±0.23 12.72±1.34 1491組 3 5.79±3.52* 16.59±2.44*陰性對照組 3 8.30±0.23* 20.62±0.52*空白組 3 － 20.07±1.80*

2.2 各組細(xì)胞的凋亡率比較 各組細(xì)胞的凋亡率的差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=373.74，P＜0.01)，HER2 siRNA+卡鉑組細(xì)胞的凋亡率均高于對應(yīng)濃度的卡鉑組。見表2。

3 討論

卡鉑是第2代鉑類化療藥，在治療肺癌方面有較好療效，能提高腫瘤控制率和患者生存率。但其毒副作用可嚴(yán)重影響患者的生存狀況和遠(yuǎn)期療效。

RNAi可應(yīng)用特異的siRNA有效抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)。由于RNAi具有高效、特異、快速、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，且能在轉(zhuǎn)錄后水平顯著抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，因而可望成為腫瘤基因治療的有效手段。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)3對HER2 siRNA轉(zhuǎn)染HER2基因高表達(dá)的肺腺癌A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，2621和1724組能抑制該基因的表達(dá)，與申萍等［2］的研究結(jié)果相似。

表2 各組肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡率比較(s)

注:與陰性siRNA+卡鉑60 mg/L組、1724+卡鉑60 mg/L組、卡鉑60 mg/L組、2621+卡鉑40 mg/L組、2621組、陰性siRNA組、空白組比較，▲P＜0.05;與陰性siRNA+卡鉑40 mg/L組、卡鉑40 mg/ L組比較，★P＜0.05;與1724+卡鉑40 mg/L組、1724組、陰性siRNA組、空白組比較，◆P＜0.05;與陰性siRNA+卡鉑40 mg/L組、陰性siRNA組、空白組比較，■P＜0.05;與卡鉑40 mg/L組、空白組比較，●P＜0.05

組別 n 凋亡率(%) 10.23±0.36陰性siRNA組 3 9.68±0.39陰性siRNA+卡鉑40 mg/L組 3 15.75±0.05陰性siRNA+卡鉑60 mg/L組 3 17.77±0.11■2621組 3 11.33±0.21 2621+卡鉑40 mg/L組 3 17.51±0.16★2621+卡鉑60 mg/L組 3 20.26±0.55▲1724組 3 11.17±0.15 1724+卡鉑40 mg/L組 3 17.41±0.71★1724+卡鉑60 mg/L組 3 18.41±0.28◆卡鉑40 mg/L組 3 15.30±0.10卡鉑60 mg/L組 3 17.93±0.06空白組3●

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，HER2基因高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌對順鉑、環(huán)磷酰胺、6氟尿嘧啶以及阿霉素的耐藥性顯著相關(guān)［3］。Valero等［4］研究發(fā)現(xiàn)，抗HER2的單克隆抗體與卡鉑、多西他賽聯(lián)用，治療HER2基因擴(kuò)增的轉(zhuǎn)移性乳腺癌有效。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用siRNA和卡鉑組細(xì)胞的凋亡率均高于對應(yīng)濃度的卡鉑組。

綜上所述，HER2 siRNA與卡鉑具有協(xié)同作用，能夠促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，為臨床探討肺腺癌治療的新途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］馮元賢，顧偉勇.C-erbB-2基因產(chǎn)物在耐藥非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)［J］.蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，18(6):557-558.

［2］申萍，張方，吳學(xué)玲，等.RNA干擾her2/neu基因表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22(3):236-239，243.

［3］王煜霞，姬明麗，李生瑩，等.c-erbB-2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌多藥耐藥的關(guān)系［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23(5):469-472.

［4］Valero V，F(xiàn)orbes J，Pegram MD，et al.Multicenter phaseⅢrandomized trial comparing docetaxel and trastuzumab with docetaxel，carboplatin，and trastuzumab as first-line chemotherapy for patients with HER2-gene-amplified metastatic breast cancer(BCIRG 007 study):two highly active therapeutic regimens［J］.J Clin Oncol，2011，29(2):149-156.