(1三峽大學(xué)分子生物研究所，湖北宜昌 443002;2三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院;3湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院)

流行病學(xué)調(diào)查顯示，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)16型感染與宮頸癌的發(fā)生有密切關(guān)系。其編碼的E7蛋白與細胞轉(zhuǎn)化和病毒復(fù)制的調(diào)控有關(guān)，能在宮頸癌組織內(nèi)及細胞系持續(xù)表達，在維持轉(zhuǎn)化組織惡性表型的過程中具有重要作用［1］。因此，以E7基因為靶點的宮頸癌基因治療已成為研究熱點。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是一種封閉基因表達的有效方法，能通過小干擾RNA(siRNA)或小發(fā)夾RNA來介導(dǎo)RNAi作用［2］。2011年7月 ～2012年2月，我們探討了HPV16 E7 siRNA表達載體對宮頸癌CaSki細胞生物學(xué)活性的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細胞株CaSki、載體pSilenceU6由本研究所保存。Trizol總RNA純化試劑和LipofectamineTM2000購自 Invitrogen公司;限制性內(nèi)切酶、T4連接酶及Taq DNA聚合酶均購自Fermentus公司。兔抗HPV16 E7單抗和β-acting鼠抗人多克隆抗體購自Santa cruz。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自Sigma公司。EPICSXL-4流式細胞儀為Beckman Coulte公司產(chǎn)品，PCR引物合成及DNA測序由上海生工公司完成。GelLogic-200凝膠圖像分析儀為美國Kodak公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 將人宮頸癌CaSki細胞置于含10%小牛血清及1%青霉素(或鏈霉素)的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、80%濕度的細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細胞傳代方法:PBS潤洗后，胰蛋白酶消化至輕拍細胞脫落;用培養(yǎng)液終止后轉(zhuǎn)至15 mL離心管，800 r/min離心3 min，棄上清液;細胞用培養(yǎng)液重懸后，以1∶3的比例傳代。

1.2.2 HPV16 E7特異性siRNA表達載體的構(gòu)建利用 Ambion網(wǎng)站 siRNA Designer設(shè)計靶向HPV16 E7 siRNA靶序列，采用BLAST軟件對選擇的靶序列進行同源分析，從HPV16 E7 mRNA基因中選擇一段19個堿基的E7特異性序列，設(shè)計1對63 bp的寡核苷酸，包括內(nèi)切酶位點及莖環(huán)結(jié)構(gòu)。HPV16 E7 siRNA靶序列上游引物:5'-GATCCGCAACAGTTACTGCGACGTTTCAAGAGAACGTCGCAGTAACTGTTGCTTTTTTGGAAA-3';下游引物:5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCAACAGTTACTGCGACGTTCTCTTGAAACGTCGCAGTAACTGTTGCG-3'。對照序列中上游引物:5'-GATCCGTGACTAGCAACGTCGTACTTCAAGAGAGTACGACGTTGCTAGTCACTTTTTTGGAAA-3';下游引物:5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTGACTAGCAACGTCGTACTCTCTTGAAGTACGACGTTGCTAGTCACG-3'。所得引物的cDNA片段克隆入經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切的真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體pSilenceU6中。用分子克隆技術(shù)獲得陽性重組質(zhì)粒pSilenceU6 HPV16 E7(E7Si)以及亂碼對照質(zhì)粒pSilenceU6 HPV16 E7-ctl(Si)。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及篩選 待CaSki細胞貼壁覆蓋率70% ～90%時，將表達載體E7Si及空載體Si按LipofectamineTM2000試劑說明書分別進行轉(zhuǎn)染。通過潮霉素(0.8 mg/mL)抗性篩選，轉(zhuǎn)染20 d后分別得到抗性克隆細胞CaSki-E7Si及陰性對照CaSki-Si。

1.2.4 RT-PCR法檢測HPV16 E7 mRNA的表達用0.8 mL Trizol試劑裂解細胞，轉(zhuǎn)至無RNase的1.5 mL EP管中;加入160 μL氯仿，顛倒混勻，室溫靜置10 min，待兩液相分層后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液至新的EP管中;加異丙醇500 μL，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液;加75%乙醇(DEPC水配制)1 mL，洗滌沉淀，4℃ 7 500 r/min離心5 min后，棄上清液并風(fēng)干，用適量去RNase水溶解沉淀，獲得細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)體系得到cDNA。再以此cDNA第1鏈為模板，以β-actin和HPV16 E7為引物進行PCR擴增。

1.2.5 流式細胞術(shù)鑒定克隆細胞HPV16 E7的表達 將在mRNA水平沉默較好的CaSki-E7Si以及空載的CaSki-Si細胞進行培養(yǎng)，待長到80% ～90%用胰酶消化分別收集細胞，各用3 mL PBS重懸，每種細胞分裝到2個流式管中，每管各取1 mL再次用3.5 mL PBS 洗滌，800 r/min 離心 3 min，去上清;用0.1%TritonX-100-PBS室溫處理10 min，PBS洗滌3次(2 000 r/min離心5 min)，去上清;將HPV16 E7的抗體按1∶800稀釋，每管中各加入100 μL，在室溫下孵育30 min。用PBS洗滌3次(2 000 r/min離心5 min)，將FITC標記的二抗按1∶500稀釋，每管中加入100 μL，室溫下避光孵育30 min。最后用PBS洗滌3次(2 000 r/min離心3 min)，用500 μL的PBS重懸細胞上機檢測。

1.2.6 細胞增殖的檢測 分別收集處于對數(shù)生長期空載CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆細胞，胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1×104/mL后接種于96孔板中，每孔100 μL。待細胞完全貼壁后，去培養(yǎng)液，加入100 μL MTT(200 μg/mL)，置于37 ℃孵育4 h，去上清液，加入DMSO 200 μL/孔，待完全溶解后于570 nm波長處檢測吸光度(OD)值，以此檢測時間點作為0 h。用同樣方法檢測細胞培養(yǎng)24、48、72和96 h各時間點的OD值，以各時間點的OD值與0 h OD值的比值反映細胞生長速度。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和化療藥物的敏感性 ①將空載CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆細胞分在6孔板中培養(yǎng)，待細胞長到70% ～80%用胰酶消化收集細胞，將收集的細胞存放于EP管中，用PBS混勻，2 500 r/min離心5 min，吸去上清廢液，用80%的乙醇(PBS配制)4℃固定。次晨取出固定好的細胞，2 500 r/min離心5 min后吸去上清廢液;再次加入PBS于EP管中混勻，2 500 r/min離心5 min后吸凈廢液，用500 μL含0.1%TritonX-100和50 μg/mL RNase的PBS混合液重懸細胞，然后加入0.5 mg/mL碘化丙錠90 μL，于37℃避光保溫30 min;尼龍膜過濾，用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。②將起始濃度為900 ng/mL順鉑(DDP)3倍梯度稀釋3個濃度備用;待鋪在6孔板中空載CaS-ki-Si和CaSki-E7Si的克隆細胞貼壁后，加入上述3個濃度的DDP培養(yǎng)液，再次培養(yǎng)48 h后收集細胞。按上述方法檢測細胞周期。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，結(jié)果比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E7 siRNA的構(gòu)建 將用分子克隆技術(shù)成功篩選出的重組質(zhì)粒pSilenceU6 HPV16 E7和亂碼對照的pSilenceU6 HPV16 E7-ctl送上海生工測序。該重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序分析證實，重組質(zhì)粒中插入的片段方向正確，堿基無突變。

2.2 克隆細胞株的鑒定 將獲得的空載CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆細胞株放大培養(yǎng)后，在蛋白和mRNA水平上篩選穩(wěn)定沉默HPV16 E7表達的細胞株。結(jié)果顯示，在所得的陽性克隆株HPV16-E7Si中，HPV16-E7Si-1在mRNA(圖1泳道3)和蛋白水平上(圖2)的表達量均顯著低于對照細胞株空載Si。

圖1 mRNA水平鑒定HPV6 E7在克隆細胞株的表達

2.3 克隆細胞株活性的檢測

2.3.1 沉默HPV16 E7基因?qū)aSki細胞增殖的影響 用MTT比色法檢測克隆細胞株E7Si與對照Si的增殖速率。結(jié)果顯示，從培養(yǎng)48 h開始，克隆細胞株的生長要明顯慢于對照細胞Si(P＜0.05)，提示沉默HPV16 E7基因后抑制CaSki細胞增殖。見圖3。

2.3.2 沉默HPV16 E7基因?qū)aSki細胞周期的影響 用流式細胞儀檢測沉默HPV16 E7基因后對CaSki細胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆細胞株E7Si凋亡峰比例明顯增多(40.9%vs 7.03%，P ＜0.01)。

圖2 流式細胞儀檢測CaSki細胞中E7蛋白的沉默

圖3 沉默HPV16 E7基因?qū)aSki細胞增殖的影響

2.3.3 沉默HPV16 E7基因后對DDP敏感性的影響 將起始濃度為900 ng/mL的DDP稀釋后作用于克隆細胞E7Si和對照空載Si細胞，培養(yǎng)48 h后收集細胞，用流式細胞儀檢測DDP對HPV16 E7基因沉默后細胞周期的影響。結(jié)果顯示，克隆細胞株E7Si G0～1期細胞明顯增多，阻止細胞于 DNA的合成前期，而對照Si則更多地是阻止細胞于合成期(S+G2+M)(P ＜0.05)。見表1、2。

表1 DDP對CaSki-E7Si細胞株細胞周期的影響(%，±s)

表1 DDP對CaSki-E7Si細胞株細胞周期的影響(%，±s)

注:與 CaSki-E7Si比較，*P ＜0.05

濃度 Sub G0～1 S G2+M CaSki-E7Si 40.9 ±7.11 31.0 ±3.88 5.2 ±0.64 12.5 ±1.06 DDP 900 ng/mL 5.8 ±1.73 53.0 ±6.03* 7.0 ±0.88 23.4 ±2.93*DDP 300 ng/mL 9.5 ±1.19 49.3 ±6.16* 8.0 ±1.20 21.6 ±2.79*DDP 100 ng/mL 17.1 ±1.14 36.7 ±4.59 8.1 ±1.01 17.4 ±2.08

3 討論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女生殖健康和生命。研究表明，高危型HPV感染，尤其是16型和18型感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的最主要因素［3，4］，病毒早期基因E7可在宮頸癌組織中持續(xù)表達，并為癌組織惡性表型的維持所必需［3，5，6］。因此，抑制E7基因在宮頸癌中的過度表達，可以為宮頸癌的基因治療提供新的線索。

表2 DDP對CaSki-Si細胞株細胞周期的影響(%，±s)

表2 DDP對CaSki-Si細胞株細胞周期的影響(%，±s)

注:與 CaSki-Si比較，*P ＜0.05

濃度 Sub G0～1 S G2+M CaSki-Si 7.0 ±0.58 57.5 ±7.19 6.3 ±0.84 14.6 ±1.83 DDP 900 ng/mL 6.5 ±0.61 13.6 ±2.70 35.8 ±4.48* 18.3 ±2.09 DDP 300 ng/mL 4.3 ±0.54 18.6 ±2.33 10.4 ±1.30 45.9 ±5.04*DDP 100 ng/mL 6.4 ±0.61 22.6 ±2.13 7.4 ±0.93 37.2 ±4.60*

目前RNAi技術(shù)已成為基因功能研究和抗病毒治療的強有力工具［7，8］。本研究采用載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)觀察其對宮頸癌CaSki細胞HPV16 E7基因的影響。本研究中，我們設(shè)計了一條HPV16 E7特異性Si和一條隨機亂碼Si作為對照，與其他核苷酸鏈無明顯同源性，保證了該siRNA對E7基因mRNA的特異性。構(gòu)建HPV早期基因E7的siRNA的真核載體，轉(zhuǎn)染到CaSki細胞中，有效沉默靶基因E7的轉(zhuǎn)錄表達進而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。同時，轉(zhuǎn)染的非特異siRNA對靶基因未見明顯的抑制效應(yīng)，進一步證實了siRNA的作用具有特異性。用脂質(zhì)體直接轉(zhuǎn)染的方法，簡單易行，且 LipofectamineTM2000在多種細胞轉(zhuǎn)染中均表現(xiàn)出穩(wěn)定、高效、低毒的特點。上述研究結(jié)果初步表明，siRNA載入CaSki細胞的活性有可能成為治療HPV相關(guān)腫瘤的一種新的手段，并為深入探討E7編碼基因在HPV相關(guān)腫瘤中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E7 siRNA表達載體轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細胞后，凋亡明顯增加;但是加用DDP作用于空載Si和HPV16 E7Si細胞株后，DDP將空載 Si的周期阻滯在 S～G2期，而將 HPV16 E7Si細胞大部分阻滯在 G0～1期，說明E7 siRNA表達載體在化療藥物的作用下能阻滯CaSki細胞由G1期進入S期。同時由生長曲線可以看出，HPV16 E7 siRNA表達載體可使CaSki細胞生長增殖減慢，而空載體卻無此作用。說明E7 siRNA表達載體可抑制其細胞增殖。分析可能原因如下:①E7基因作為一種癌基因，其主要致癌機制為E7編碼蛋白干擾視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(pRb)與E2F的結(jié)合，使pRb-E2F復(fù)合物解離，E2F被游離，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用，使細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細胞調(diào)節(jié)失控，發(fā)生永生化［9］;②DDP是鉑的金屬絡(luò)合物，其主要靶點為DNA，破壞其復(fù)制而發(fā)揮細胞毒作用［10］。細胞通過2個限制點(G1/S期和G2/M期限制點)保證細胞的復(fù)制。且有研究表明，細胞周期的阻滯與細胞凋亡、分化密切相關(guān)。

綜上所述，HPV16 E7 siRNA表達載體可通過有效抑制宮頸癌CaSki細胞E7基因的表達來調(diào)控腫瘤細胞周期，抑制腫瘤細胞的惡性增殖，從而部分逆轉(zhuǎn)其惡性表型，并且增加了DDP的敏感性。因此，通過RNAi干擾聯(lián)合化療可為腫瘤治療提供新的思路。

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