瞿茹怡，徐玉梅，鄭 潔，陸 詠

(上海市第一人民醫(yī)院分院，上海200092)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病率為20/ 10萬～50/10萬［1］，女性多于男性。臨床研究顯示，75%的女性RA患者在妊娠期間癥狀緩解，尤其在妊娠最后3個(gè)月癥狀明顯改善;90%的RA患者在分娩后數(shù)周或數(shù)月血清類風(fēng)濕因子(RF)升高;口服避孕藥可緩解病情。這些研究結(jié)果表明，雌激素在RA發(fā)病中具有重要作用。雌激素主要通過雌激素受體(ER)發(fā)揮作用，因而ER基因多態(tài)性可能影響雌激素的作用，進(jìn)而影響RA的發(fā)病和臨床表現(xiàn)。2008～2011年，我們觀察了 RA患者 ER基因rs2234693和rs9340799位點(diǎn)多態(tài)性與RA的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇在我院診治的女性RA患者160例(觀察組)，年齡(56.43±9.22)歲，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。同期選擇我院健康體檢女性150例作為對(duì)照組，年齡(57.31±9.92)歲。兩組年齡比較具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 所有研究對(duì)象入院當(dāng)天詢問病史，包括年齡、起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛個(gè)數(shù)、關(guān)節(jié)畸形個(gè)數(shù)、晨僵情況等。次日晨抽空腹血10 mL，同步留取EDTA抗凝的全血1 mL。全血經(jīng)離心分離血漿和血細(xì)胞后，－80℃冰箱凍存。取血漿采用透射比濁法檢測(cè)RF;血細(xì)胞用于抽提DNA。

1.2.2 ER基因型分析 ①DNA抽提:選擇DNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)，嚴(yán)格按說明書操作，步驟簡述如下:血細(xì)胞經(jīng)裂解后，上硅膠膜吸附柱，然后經(jīng)洗滌、洗脫等步驟，獲得較純的DNA樣品，再用紫外分光光度計(jì)(Eppendorf，德國)測(cè)定濃度。②目的序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序:根據(jù)Gene-Bank提供的ER基因序列，用Primer Express2.0軟件設(shè)計(jì)引物(引物由上海生工合成)，ER基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位點(diǎn)測(cè)序的引物序列:上游引物:5'-ACAATTCTCCTGCTTTGGCC-3'，下游引物:5'-GAGACCAATGCTCATCCCAAC-3';PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，62℃ 40 s，72℃ 60 s。共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，Hardy-Weinberg檢驗(yàn)證實(shí)有群體代表性。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ER基因rs2234693、rs9340799位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果兩組均經(jīng)測(cè)序分型，結(jié)果見圖1。rs2234693位點(diǎn)在兩組中存在C或T兩種變異(左側(cè)第6個(gè)堿基)，其基因型分別為TT、CT、CC型;rs9340799位點(diǎn)在兩組中存在A或G兩種變異(右側(cè)第6個(gè)堿基)，其基因型分別為AA、AG、GG型。

2.2 兩組ER基因rs2234693和rs9340799位點(diǎn)多態(tài)性比較 根據(jù)SNP位點(diǎn)rs2234693、rs9340799的基因型，2個(gè)位點(diǎn)排列組合，可得9種基因型:CC/ GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/GA、CC/ AA、TC/AA和TT/AA。兩組基因型比較見表1。

圖1 ER基因rs2234693和rs9340799位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

2.3 兩組ER等位基因和基因型比較 見表2。

2.4 觀察組ER基因型與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系GG、AG、AA、CC、TC、TT六種基因型在起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.5 觀察組ER基因型多態(tài)性與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系 CC/GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/ GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA九種基因型與起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)、晨僵和RF陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)節(jié)畸形數(shù)TT/GA型少于CC/GG、TG/GG、TC/GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA型，其他基因型間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于各組例數(shù)較少，TT/GA型僅有8例，這種差異是否有臨床意義，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。見表4。

表1 兩組ER基因rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位點(diǎn)多態(tài)性比較［例(%)］

表2 兩組ER等位基因和基因型比較［例(%)］

表3 觀察組ER基因型與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系

3 討論

表4 觀察組ER基因多態(tài)性與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系

RA是一類關(guān)節(jié)軟組織的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。多數(shù)研究認(rèn)為與遺傳、環(huán)境等多因素有關(guān);其中遺傳因素有HLA-DRB1和PTPN22等基因，環(huán)境因素包括吸煙、感染等。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在RA發(fā)病中具有重要作用，其通過與ER結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此，ER基因多態(tài)性和變異性將影響雌激素的作用。研究發(fā)現(xiàn)，ER多態(tài)性(尤其是ERa的基因多態(tài)性)可能與乳腺癌、血脂代謝異常、動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松等有關(guān)。目前，關(guān)于ER多態(tài)性與RA的相關(guān)性研究較少。

人體ER基因位于染色體6q24～27區(qū)域，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，全長140 kb，編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為66 kD的蛋白質(zhì)。ER位于胞核或胞質(zhì)內(nèi)，與雌激素結(jié)合后，具有轉(zhuǎn)錄因子的作用。ER與雌激素結(jié)合后轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，與靶基因中的雌激素反應(yīng)元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，1號(hào)內(nèi)含子具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，該區(qū)域堿基的改變(SNP或突變)會(huì)影響ER的表達(dá)和功能。據(jù)報(bào)道［2］，1號(hào)內(nèi)含子中rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位點(diǎn)多態(tài)性與ER的表達(dá)和功能有關(guān)，可影響雌激素的作用。

國內(nèi)外的研究顯示，ER基因 rs2234693和rs9340799位點(diǎn)多態(tài)性與多種疾病有關(guān)，如乳腺癌、骨質(zhì)疏松癥以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等［3］。Ushiyama等［4］發(fā)現(xiàn)，日本女性ERa PPxx基因型較XXPP、xxpp基因型RA發(fā)病早;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，ER基因rs2234693和rs9340799位點(diǎn)的不同亞型與RF及類風(fēng)濕結(jié)節(jié)的出現(xiàn)無明顯相關(guān)性。Takagi等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ER基因亞型雖與RA的發(fā)病年齡、RF陽性率以及腕骨的骨密度變化無明顯相關(guān)性，但與RA的發(fā)病有關(guān)。國內(nèi)蘇茵等研究發(fā)現(xiàn)，我國女性RA的發(fā)病與ER基因XbaⅠ和PvuⅡ酶切多態(tài)性存在密切的相關(guān)性，其通過分析RA患者ER基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，X和P的基因頻率表達(dá)明顯增高。說明這兩種等位基因可能與RA發(fā)病有一定的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組CC/GG的基因型陽性率顯著高于對(duì)照組，TT/AA基因型的陽性率顯著低于對(duì)照組，其他基因型兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;觀察組C和G等位基因明顯高于對(duì)照組，GG和CC基因型也顯著高于對(duì)照組，而AA和TT基因型明顯低于對(duì)照組;2個(gè)位點(diǎn)的雜合型在組間沒有差異。表明C和G等位基因可能是RA發(fā)病的危險(xiǎn)因素，而A和T等位基因可能是保護(hù)因素。分析GG、AG、AA、CC、TC、TT六種基因型，可見起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率在組間均未見顯著差異，提示ER基因rs2234693和rs9340799位點(diǎn)多態(tài)性與RA的發(fā)病有關(guān)，而與病情嚴(yán)重程度無關(guān)。進(jìn)一步分析CC/GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA九種基因型多態(tài)性與起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率之間的關(guān)系，組間亦未見顯著差異。這和前人的研究結(jié)果［5，6］基本一致。表明ER rs2234693和rs9340799兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能僅與RA的發(fā)病有關(guān)。關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率等可能有多種因素參與有關(guān)，如炎癥因子(TNF-a，IL-6及其受體)［7，8］、治療時(shí)間及治療方案等。

總之，ER基因rs2234693和rs9340799位點(diǎn)的多態(tài)性與RA的發(fā)病相關(guān)，雌激素在RA的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。

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