王洪波，樊鳳艷，劉 娟，祁術(shù)元

（空軍總醫(yī)院輸血科，北京 100142）

呼吸道給藥誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的實(shí)驗(yàn)研究

王洪波，樊鳳艷，劉 娟，祁術(shù)元

（空軍總醫(yī)院輸血科，北京 100142）

目的探討干擾素(IFNs)誘導(dǎo)劑從鼻腔給藥，能否誘導(dǎo)呼吸道局部黏膜產(chǎn)生足量干擾素，預(yù)防呼吸道病毒感染性疾病。方法選用干擾素誘導(dǎo)劑聚肌胞、新城疫疫苗、阿比朵爾和刺五加多糖溶液，連續(xù)15 d從鼻腔滴入，然后檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液和鼻腔分泌物中的干擾素含量。結(jié)果⑴各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血清中檢測(cè)的干擾素含量比空白對(duì)照組明顯低；鼻腔分泌物中檢測(cè)的干擾素含量則比空白對(duì)照組明顯高。說明通過鼻腔給予干擾素誘導(dǎo)劑，對(duì)血液中干擾素的產(chǎn)生無促進(jìn)作用，對(duì)呼吸道黏膜干擾素的產(chǎn)生有誘導(dǎo)和促進(jìn)作用。⑵與空白對(duì)照組比較，除刺五加多糖高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)、刺五加多糖低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，其他各實(shí)驗(yàn)組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。⑶實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)鼻腔滴入上述制劑，有較好的適應(yīng)性。結(jié)論聚肌胞、新城疫疫苗、阿比朵爾、刺五加多糖可以做為通過呼吸道給藥的高效干擾素誘導(dǎo)劑，用于探討預(yù)防和治療人類呼吸道病毒感染性疾病。

干擾素；誘導(dǎo)劑；預(yù)防；呼吸道；病毒感染

為了探討干擾素(IFNs)誘導(dǎo)劑從鼻腔滴入給藥，能否誘導(dǎo)呼吸道局部黏膜產(chǎn)生足量干擾素，預(yù)防呼吸道病毒感染性疾病，筆者對(duì)通過文獻(xiàn)檢索篩選出4種高效干擾素誘導(dǎo)劑[1-5]進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 干擾素誘導(dǎo)劑 雞新城疫耐熱保護(hù)劑活疫苗(La Sota株)，批號(hào)20100101，血凝效價(jià)微量法1028、全量法1280，用5 ml注射用水稀釋(A液)；0.1%聚肌胞溶液(B液)，廣州天心制藥廠生產(chǎn)；0.017%刺五加多糖溶液(C液)，西安天一生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)30%刺五加多糖粉劑，批號(hào)090303；0.1%鹽酸阿比朵爾溶液(D液)，蘇州長(zhǎng)征-欣凱制藥有限公司生產(chǎn)鹽酸阿比朵爾粉劑，批號(hào)090501；硝酸毛果蕓香堿滴眼液(匹羅卡品)，沈陽興齊制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)091101，規(guī)格8 ml：80 mg。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，5~8周齡，質(zhì)量25~30 g，SPF級(jí)。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物共計(jì)140只，分組如下：實(shí)驗(yàn)組：分為A、B、C、D四組，A組為新城疫活疫苗組，B組為聚肌胞組，C組為刺五加多糖組，D組為阿比朵爾組；每組再分為高劑量、低劑量?jī)蓚€(gè)劑量組，每個(gè)劑量組14只，共計(jì)112只。對(duì)照組：包括注射用水對(duì)照組(E組)和匹羅卡品對(duì)照組(F組)，每組14只。

1.3 試驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)組(A、B、C、D組)按每只小鼠30 μl/次(每側(cè)鼻腔各15 μl/次)鼻腔(點(diǎn))滴入的方式給藥，高劑量組每日上午、下午各一次，分別給予A、B、C、D液；低劑量組僅每日上午給藥一次。均連續(xù)給藥15 d，同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥后的反應(yīng)(有無活動(dòng)弱、倦縮、食量減少、毛色差、嘶咬等)。于給藥后第16天采集小鼠呼吸道及鼻腔分泌液和血清。

對(duì)照組按每只小鼠30 μl/次(每側(cè)鼻腔各15 μ l/次)鼻腔(點(diǎn))滴入的方式給予注射用水，每日上午一次。

匹羅卡品空白對(duì)照組按每只小鼠30 μl/次(每側(cè)鼻腔各15 μl/次)鼻腔(點(diǎn))滴入的方式給予注射用水，每日上午一次。但是在采集(呼吸道分泌液和)血清前，不注射0.01%匹羅卡品，也不采集呼吸道及鼻腔分泌液。

1.4 采集呼吸道及鼻腔分泌液和血清的方法 先給實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射0.01%匹羅卡品600 μl/只/次)，3 min后采集呼吸道及鼻腔分泌液，置于0.5 ml EP管中，-20℃保存[2]。然后再采用摘除眼球的方法，采集小鼠血液，分離血清，置于0.5 ml EP管中，-20℃保存。分別檢測(cè)呼吸道及鼻腔分泌液和血清中的干擾素[6-7]。干擾素檢測(cè)試劑由尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司提供。檢測(cè)儀器全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中檢測(cè)的干擾素含量均比空白對(duì)照組明顯低；各實(shí)驗(yàn)組呼吸道及鼻腔分泌物中檢測(cè)的干擾素含量均比空白對(duì)照組明顯高。由于皮羅卡品對(duì)照組動(dòng)物沒有注射皮羅卡品，無法采集鼻腔分泌液，無法檢測(cè)干擾素，見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)組間小鼠呼吸道及鼻腔分泌液的干擾素含量比較 各實(shí)驗(yàn)組中高、低劑量組檢測(cè)的呼吸道及鼻腔分泌液干擾素含量結(jié)果間橫向比較，聚肌胞高、低劑量組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他各高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，選取了兩組(分別以*和#標(biāo)記)有代表意義的數(shù)據(jù)，進(jìn)行縱向交叉比較(不同實(shí)驗(yàn)組、不同劑量組間)，聚肌胞高劑量組與阿比朵爾低劑量組間、新城疫疫苗低劑量組與阿比朵爾低劑量組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見表2。

表1 各組小鼠血清中INF-a檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/ml）

表1 各組小鼠血清中INF-a檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/ml）

對(duì)照組新城疫疫苗組聚肌胞組刺五加多糖組阿比朵兒組注射用水組皮羅卡品組高劑量組低劑量組高劑量組低劑量組高劑量組低劑量組高劑量組低劑量組14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 87.2±76.1 78.2±21.6 61.1±11.7 41.9±17.0 60.3±18.3 31.2±16.6 8.5±7.6 27.7±12.2 35.3±23.7 16.7±12.7 17.3±15.2 -93.9±31.6 125.1±19.2 135.6±20.0 37.2±17.3 37.2±17.3 39.5±14.8 72.3±11.4 79.7±12.0

表2 高、低劑量組間鼻腔分泌液INF-α檢測(cè)結(jié)果比較（±s，pg/ml）

表2 高、低劑量組間鼻腔分泌液INF-α檢測(cè)結(jié)果比較（±s，pg/ml）

注：聚肌胞高劑量組與阿比朵爾低劑量組比較，*P<0.01；新城疫疫苗低劑量組與阿比朵爾低劑量組比較，#P<0.01。

新城疫疫苗組聚肌胞組刺五加多糖組阿比朵兒組93.9±31.6 135.6±20.0* 32.6±19.6 72.3±11.4 125.1±19.2# 37.2±17.3 39.5±14.8 79.7±12.9*#＞0.05＜0.01＞0.05＞0.05

2.3 實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組小鼠呼吸道及鼻腔分泌液檢測(cè)的干擾素含量比較 各實(shí)驗(yàn)組呼吸道及鼻腔分泌液檢測(cè)的干擾素含量分別與注射用水對(duì)照組比較，除刺五加多糖組高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明聚肌胞、新城疫疫苗、阿比朵爾制劑均可以通過鼻腔滴入給藥，并且均能較好地誘導(dǎo)呼吸道黏膜產(chǎn)生干擾素。

3 討論

以流感為代表的呼吸道病毒感染性疾病，由于其多發(fā)性和變異性，一直困擾著相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究、預(yù)防和治療。干擾素具有廣譜非特異性抗病毒作用，且流感、副流感等呼吸道感染性病毒幾乎全對(duì)其敏感早有定論[8]，但是由于外源性干擾素價(jià)格較高和具有一定的副作用，限制了其在預(yù)防呼吸道病毒感染性疾病中的廣泛使用。IFNs誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)機(jī)體自身上皮細(xì)胞(含呼吸道黏膜上皮細(xì)胞)產(chǎn)生IFNs，使局部形成抗病毒狀態(tài)也有定論[9]。IFNs誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，國內(nèi)外報(bào)道較多的是和抗病毒藥物(如IFNs、病毒唑等)同時(shí)應(yīng)用治療病毒感染性疾病(如流感、流行性出血熱、乙型肝炎等)。近年來國外已有報(bào)道，單獨(dú)采用IFNs誘導(dǎo)劑涂(軟膏)于鼻腔、滴(液體)入鼻腔或口服(片劑)等方式預(yù)防和治療呼吸道病毒感染性疾病(包括流感)，比如文獻(xiàn)報(bào)道的使用Ridostine、Poludane、Cycloferon等可使病程明顯縮短、癥狀減輕、死亡率降低[10-13]。但是，將該類藥物直接、單獨(dú)應(yīng)用于呼吸道局部，探討預(yù)防呼吸道病毒感染性疾病，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

本研究對(duì)比觀察新城疫活疫苗、聚肌胞、刺五加多糖和阿比朵爾溶液誘導(dǎo)小鼠呼吸道產(chǎn)生IFNs的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：⑴各實(shí)驗(yàn)組呼吸道及鼻腔分泌液中檢測(cè)的干擾素，除刺五加多糖低劑量組與注射用水對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他實(shí)驗(yàn)組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明通過鼻腔滴(噴)入適當(dāng)劑量高效干擾素誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)呼吸道黏膜產(chǎn)生干擾素。⑵各實(shí)驗(yàn)組血清中檢測(cè)出的干擾素均比空白對(duì)照組低，說明通過鼻腔滴入干擾素誘導(dǎo)劑，對(duì)血液中干擾素的產(chǎn)生無促進(jìn)作用。各實(shí)驗(yàn)組呼吸道及鼻腔分泌物中檢測(cè)的干擾素含量均明顯高于空白對(duì)照組，說明通過鼻腔給予干擾素誘導(dǎo)劑，對(duì)呼吸道黏膜產(chǎn)生干擾素有促進(jìn)作用。聚肌胞高劑量組和新城疫疫苗高、低劑量組鼻腔分泌物干擾素含量明顯較高；其次是阿比朵爾高、低劑量組。刺五加多糖低劑量組結(jié)果不理想。⑶在實(shí)驗(yàn)過程中，未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有異常反應(yīng)，說明動(dòng)物對(duì)聚肌胞、新城疫疫苗和阿比朵爾的鼻腔滴入給藥有較好的適應(yīng)性。上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果在國內(nèi)首先證明：呼吸道單獨(dú)給予干擾素誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)局部產(chǎn)生干擾素，達(dá)到了預(yù)期實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。聚肌胞、新城疫疫苗、阿比朵爾和刺五加多糖制劑，均可做為通過呼吸道給藥的高效干擾素誘導(dǎo)劑，用于探討預(yù)防和治療人類呼吸道病毒感染性疾病。尤其是由于呼吸道局部給藥，可以在較短時(shí)間內(nèi)在呼吸道局部形成廣譜抗病毒狀態(tài)，比注射疫苗產(chǎn)生特異性抗體時(shí)間更短、抗病毒范圍面寬，對(duì)于應(yīng)急預(yù)防一些對(duì)干擾素敏感的已知或未知呼吸道病毒感染性疾病具有重要的意義。另外，上述干擾素誘導(dǎo)劑國內(nèi)資源豐富，生產(chǎn)工藝流程不復(fù)雜，比較容量在短期內(nèi)大量生產(chǎn)，可以用于對(duì)干擾素敏感的呼吸道病毒感染性疾病的暴發(fā)流行的預(yù)防和治療。

[1]王國良,劉善紅,宋淑英,等.聚肌胞滴鼻液佐治小兒反復(fù)呼吸道感染的臨床及免疫功能觀察[J].中國實(shí)用兒科雜志,2001,16(9): 555-556.

[2]沈富兵,鄭崛村,程曦,等.新城疫病毒合用中藥黃芪誘生內(nèi)源性干擾素的研究[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,3(1):24-60.

[3]靳玉琴, 孫 飛,張淑琴,等.鹽酸阿比朵爾抗流感病毒感染的藥效研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2004,20(10):1150-1152.

[4]周一平,蔣景儀,陳四艷,等.阿比朵爾對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,24(11):989-991.

[5]錢 農(nóng),楊吉成,盛偉華,等.人參多糖及其皂甙等五種中藥提取物促生人干擾素的研究[J].蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,17(1):31-32.

[6]司 剛,符珍珠,李 洪,等.布地奈得對(duì)支氣管哮喘患兒血清中IL-4、IL-13和IFN-r水平的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2011,22(18): 113-115.

[7]殷宗寶,鄧 超,李 英,等.甘草酸二銨對(duì)博萊霉素致肺纖維化大鼠的治療作用[J].重慶醫(yī)學(xué),2011,40(2):122-124.

[8]候云德.分子病毒學(xué)[M].北京:學(xué)苑出版社,1990:86-9.

[9]向近敏.病毒分子生態(tài)學(xué)[M].武漢大學(xué)出版社,2004:75-78.

[10]Masycheva VI,Danilenko ED,Sergeev AN.The influence of interferon inducer,a stimulator of innate immunity,on influenza[J].Eur J Immuno,2009,39(1):250.

[11]Shumilov VI,Ivannikov IG,Ogarkov PI,et al.Epidemiologic effectivness of poludane in preventing influenza and other acute respiratory diseases in troops[J].Voen Med Zh,2002,323:(1):45-47,93.

[12]Romantsov MG,Ershov FI,Kovalenko AL.Problems in treating influenza and acute respiratory infection in children[J].Eksp Klin Farmakol,2011,74(6):41-45.

[13]Romantsov MG,Golofeevskiǐ SV.Cycloferon efficacy in the treatment of acute respiratory tract viral infection and influenza during the morbidity outbreak in 2009-2010[J].Antibiot Khimioter,2010, 55:(1-2):30-35.

Study on interferon induced by respiratory tract medication.

WANG Hong-bo,FAN Feng-yan,LIU Juan,QI Shu-yuan.Department of Blood Transfusion,the General Hospital of Air Force,Beijing,100142,CHINA

ObjectiveTo explore whether the interferon(IFNs)inducer through nasal administration can induce local respiratory mucosa to produce sufficient amount of interferon,and to prevent respiratory tract virus infections.MethodsFour interferon inducers,Poly I:C,Newcastle disease virus vaccine,Arbidol,Polysaccharides of Acanthopanax senticobas(PAS)solution,were applied through nasal administration for 15 days,and then the levels of interferon in animal blood and nasal secretions were detected.Results(1)The detected interferon levels in the serum were significantly lower in the experimental groups than the control group,and that in the nasal secretions were significantly higher in the experimental groups than the control group,which indicated that interferon inducers trough nasal administration can not promote the production of interferon in the blood,but can induce and promote respiratory mucosa to produce interferon.(2)Compared with the control group,the detected interferon levels of Polysaccharides group with low dose(P<0.05)and other experimental groups(P<0.01)were significantly promoted(P<0.05)except for Polysaccharides group with high dose(P>0.05).(3)Experimental animals treated with above mentioned interferon inducers through nasal administration had good adaptability.ConclusionThe four interferon inducers,Poly I:C, Newcastle disease virus vaccine,Arbidol,PAS solution through nasal administration can prevent and treat infections of respiratory tract virus.

Interferon(IFNs);Inducer;Prevention;Respiratory tract;Virus infection

R183.3

A

1003—6350（2012）19—016—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.19.006

王洪波（1956—），男，河南省濮陽市人，主任技師，本科。

2012-07-13)

·臨床研究·