陳麗杰，商光來(lái)，袁文杰，吳又多，白鳳武

大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

丁醇作為一種新型的生物燃料，具有其獨(dú)特的性質(zhì)：能量密度高、腐蝕性低、揮發(fā)性低[1]，與汽油的性質(zhì)相似，可直接用于現(xiàn)有的發(fā)動(dòng)機(jī)系統(tǒng)，已受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。目前丁醇發(fā)酵中，丁醇的產(chǎn)量相對(duì)較低，這加大了后續(xù)分離成本，降低了其經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，因此提高丁醇產(chǎn)量是提高丁醇產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)性的手段之一[2]。微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中，微生物菌種起著至關(guān)重要的作用。性狀優(yōu)良的高產(chǎn)菌株可以減少發(fā)酵和產(chǎn)物分離成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，具有良好的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)潛力[3]，因此獲得一株高產(chǎn)丁醇菌株成為提高丁醇產(chǎn)量的前提。丁醇本身對(duì)發(fā)酵菌株C. acetobutylicum 具有很大的毒性。當(dāng)丁醇濃度達(dá)到10~11 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制，并大量死亡[4]，從而限制更高濃度丁醇的生成，因此菌體對(duì)丁醇的耐受性低也是制約丁醇產(chǎn)量提高的重要因素[5]。

核糖體是微生物進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的重要細(xì)胞器，與胞內(nèi)代謝活動(dòng)、基本生理過(guò)程密切相關(guān)。核糖體發(fā)生突變將嚴(yán)重影響胞內(nèi)物質(zhì)的代謝[6]。核糖體工程技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的微生物育種方法。通過(guò)向微生物核糖體組分 (核糖體蛋白和 rRNA) 引入點(diǎn)突變，調(diào)控代謝系統(tǒng)，誘導(dǎo)或刺激代謝產(chǎn)物的表達(dá)，獲得代謝產(chǎn)物合成能力提高的突變菌株[7-8]。通常使用鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素誘變微生物，使其核糖體發(fā)生突變。核糖體工程技術(shù)具有較好的誘變效果，目前主要用于提高微生物代謝物的產(chǎn)量及化學(xué)耐受程度等[6,9-10]。Kurosawa等[11]以枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis 168為出發(fā)菌誘變獲得鏈霉素突變株，其α-amylase和protease產(chǎn)量提高了 20%~30%。Hosokawa等[12]對(duì)惡臭假單胞菌Pseudomonas putida KH146-2進(jìn)行鏈霉素、利福平和慶大霉素的抗性誘變，篩選得到的抗生素突變株對(duì) 4-羥基苯甲酸丁酯耐受程度由出發(fā)菌的0.8%提高到5%。

與其他的育種方法相比，核糖體工程簡(jiǎn)單易行，無(wú)需特殊設(shè)備，便于大批量的篩選。在所使用的抗生素中，鏈霉素誘變效果較好，正突變和增產(chǎn)率高，且其抗性突變?cè)谡T變育種中應(yīng)用較多[10]。核糖體工程用于C. acetobutylicum的誘變篩選，以提高丁醇產(chǎn)量目前還沒(méi)有報(bào)道。鑒于此，本文通過(guò)核糖體工程技術(shù)，使用鏈霉素誘變C. acetobutylicum L7，期望獲得高產(chǎn)高耐丁醇菌株，解決丁醇產(chǎn)量低的實(shí)際問(wèn)題，并為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室馴化保存的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖70，CH3COONH42.3，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，酵母粉2，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01，pH 5.5。

平板培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖30，CH3COONH42.3，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，胰蛋白胨6，瓊脂20，pH 6.2。

抗生素：配制濃度為20 g/L的鏈霉素母液，保存于?20 ℃。使用時(shí)按一定比例稀釋。

所用培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

菌種活化：將1 mL冷凍保藏的菌種接種于20 mL活化培養(yǎng)基中，37.5 ℃厭氧箱 (Forma 1029，Thermo Fisher Scientific) 中活化培養(yǎng)。

搖瓶培養(yǎng)：將活化好的菌種以10% (V/V)的接種量接種于110 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37.5 ℃厭氧箱中靜置培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：1.2 L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入3 L發(fā)酵罐(1.5BG-4-3000，上海保興生物公司) 中，通氮?dú)?0 min，保證罐內(nèi)厭氧環(huán)境。將菌種以10% (V/V)的接種量接于發(fā)酵罐內(nèi)，發(fā)酵溫度37.5 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.2.2 菌體濃度的測(cè)定

在620 nm測(cè)量菌體的吸光度作為菌體的濃度 (OD620)，空白對(duì)照為離心后的發(fā)酵液。

1.2.3 鏈霉素最小抑菌濃度的確定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液 (OD620≈1.0) 涂布于含有不同濃度 (0、2、4··10··50) mg/L的鏈霉素平板上，每個(gè)平板100 μL，相同鏈霉素濃度設(shè)置3個(gè)平行，37.5 ℃厭氧箱中培養(yǎng)2 d，觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況，記錄無(wú)菌落生長(zhǎng)的最小鏈霉素濃度，即為鏈霉素對(duì)C. acetobutylicum L7的最小抑菌濃度[13]。

1.2.4 核糖體工程誘變篩選 C. acetobutylicum L7技術(shù)路線(xiàn)

使用鏈霉素對(duì)C. acetobutylicum L7進(jìn)行核糖體工程誘變育種。將活化好的菌液涂布于含有4~5倍MIC的鏈霉素平板上，培養(yǎng)4~5 d。挑取直徑較大或形態(tài)與原始菌有差異的菌落，96深孔板活化培養(yǎng)20 h，以10% (V/V)的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，氣相色譜檢測(cè)丁醇產(chǎn)量，比較得出產(chǎn)量提高較多的菌株 (以原始菌為對(duì)照)。再以其為出發(fā)菌，涂布獲得單菌落，將其挑至鏈霉素平板上，此時(shí)濃度比前次篩選菌株時(shí)增加5 mg/L，挑取菌落進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)，重復(fù)以上步驟直到獲得高產(chǎn)菌株。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間大批量的誘變篩選，最終獲得丁醇產(chǎn)量提高率在10%左右的菌株。以上操作均在37.5 ℃厭氧箱中進(jìn)行。誘變篩選技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示。

1.2.5 氧化還原電位 (ORP) 和pH值的測(cè)定

分別采用氧化還原電極 (Pt4805-DPAS-SCK8S, Mettler Toledo) 和 pH電極 (405-60-T-S7/ 120/9848，Mettler Toledo) 測(cè)定。

1.2.6 糖濃度的測(cè)定

葡萄糖濃度使用SBA-40E生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所) 測(cè)定。發(fā)酵液離心，取上清稀釋至糖濃度小于1 g/L，取25 μL稀釋液直接進(jìn)樣，讀取數(shù)值，并計(jì)算發(fā)酵液的糖濃度。

圖1 核糖體工程篩選丁醇高產(chǎn)菌路線(xiàn)圖Fig. 1 Schematic diagram of screening for high butanol-yield strain by ribosome engineering.

1.2.7 溶劑及有機(jī)酸的測(cè)定

Agilent6890氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中各溶劑的含量。檢測(cè)條件：毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm× 0.50 μm)，柱溫120 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；FID檢測(cè)器溫度300 ℃。H2流速40 mL/min；空氣流速 400 mL/min；N2流速 30 mL/min，進(jìn)樣量0.2 μL。采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)量，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

Waters1525液相色譜測(cè)定有機(jī)酸濃度。檢測(cè)條件：Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱(300 mm×7.8 mm)，柱溫 50 ℃，二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，示差折光檢測(cè)器溫度50 ℃。流動(dòng)相及流速：0.005 mol/L H2SO4，0.5 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.8 發(fā)酵液粘度測(cè)定方法

采用NDJ-1旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì) (上海方瑞儀器有限公司) 測(cè)定。選擇合適轉(zhuǎn)子，將其浸沒(méi)在待測(cè)發(fā)酵液中，室溫下調(diào)整到合適的轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液粘度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 丁醇耐性實(shí)驗(yàn)

將活化好的菌種以 5% (V/V)的接種量接種于500 mL活化培養(yǎng)基中，37.5 ℃厭氧箱中培養(yǎng)。待菌體生長(zhǎng)到OD620≈1.0時(shí)，充分混勻，分裝于4個(gè)搖瓶中，每瓶100 mL，添加丁醇至濃度為0、 6、12、14 g/L。測(cè)定不同丁醇濃度下菌體的生長(zhǎng)情況，以O(shè)D620表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉素對(duì)C. acetobutylicum L7的最小抑菌濃度

微生物具有一定的抗生素耐受濃度，高抗生素濃度下微生物全部被殺死，而低濃度下則發(fā)生突變的概率極低，不易獲得突變菌株[14]，因此確定抗生素篩選濃度非常重要。合適的抗生素濃度將有利于誘變工作的進(jìn)行，提高誘變效率。最小抑菌濃度 MIC是反應(yīng)抗菌活性和能力的一個(gè)指標(biāo)，定義抗生素的 MIC為無(wú)菌落生長(zhǎng)的最小抗生素濃度。

按照 1.2.3方法進(jìn)行平板涂布，并記錄不同鏈霉素濃度下C. acetobutylicum L7菌落生長(zhǎng)情況，如圖2所示。從圖中可以看出，無(wú)鏈霉素的平板中，C. acetobutylicum L7生長(zhǎng)好，培養(yǎng)至2 d時(shí)菌體鋪滿(mǎn)整個(gè)平板，無(wú)單菌落 (圖A)；在含有鏈霉素的平板上，菌體生長(zhǎng)受到抑制。10 mg/L鏈霉素濃度下，C. acetobutylicum L7在2 d內(nèi)無(wú)菌落生長(zhǎng) (圖B)，確定10 mg/L為MIC；在40~50 mg/L的鏈霉素平板中，大部分菌體被殺死，培養(yǎng)至4 d只有2~4個(gè)菌落存活，形態(tài)如圖C和圖D。生長(zhǎng)出的菌落為鏈霉素抗性菌，有可能發(fā)生突變。

在確定鏈霉素的MIC后，按照1.2.4設(shè)計(jì)的技術(shù)路線(xiàn)，通過(guò)平板轉(zhuǎn)接逐次提高鏈霉素濃度開(kāi)始誘變篩選C. acetobutylicum L7，以獲得丁醇高產(chǎn)菌株。

2.2 丁醇高產(chǎn)菌S3的獲得及傳代穩(wěn)定性

得到丁醇高產(chǎn)的 C. acetobutylicum一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。通過(guò)使用鏈霉素的核糖體工程育種技術(shù)大批量篩選，共獲得 6株丁醇產(chǎn)量較高的菌株，其中7倍MIC鏈霉素抗性菌株S3丁醇產(chǎn)量最高，達(dá)到(12.00±0.10) g/L，如表 1所示。

通過(guò)分析表中篩選結(jié)果，得出鏈霉素用于誘變C. acetobutylicum提高丁醇產(chǎn)量，效果比較理想?？剐跃?，S13丁醇產(chǎn)量最低，為(11.72±0.11) g/L，提高了10.05%；其他5株菌丁醇產(chǎn)量提高率在10.14%~12.68%。

連續(xù)傳代次數(shù)用于表達(dá)微生物菌株的使用壽命。傳代穩(wěn)定說(shuō)明菌株性狀優(yōu)良，不易衰退[15]。通過(guò)核糖體工程技術(shù)篩選所獲得的6株菌，對(duì)其進(jìn)行傳代發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)S3的發(fā)酵性能最穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表2。從表中可以看出，傳代5次，S3的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量較穩(wěn)定，分別維持在11.8 g/L和18.7 g/L左右，相比于原始菌一直穩(wěn)定高產(chǎn)；丁醇在總?cè)軇┲兴急壤秊?.62~0.63。說(shuō)明S3遺傳穩(wěn)定性較好，有利于后續(xù)研究的進(jìn)行。

2.3 S3與C. acetobutylicum L7的生長(zhǎng)及發(fā)酵特性

為考察S3生長(zhǎng)及發(fā)酵情況，將S3進(jìn)行上罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并與原始菌進(jìn)行了對(duì)比。兩者的生長(zhǎng)、耗糖、各溶劑、有機(jī)酸的生成及 ORP變化情況如圖3~5所示。

圖2 鏈霉素平板中C. acetobutylicum L7的生長(zhǎng)情況Fig. 2 The growth of C. acetobutylicum L7 on streptomycin plates with different concentrations. (A) 0 mg/L streptomycin. (B) 10 mg/L streptomycin. (C) 40 mg/L streptomycin. (D) 50 mg/L streptomycin.

表1 核糖體工程用于C. acetobutylicum L7的篩選結(jié)果Table 1 The high butanol-producing Clostridium strains by ribosome engineering

表2 S3傳代穩(wěn)定性Table 2 The genetic stability of S3

圖3 原始菌 (A) 和S3 (B) 的OD620、pH及殘?zhí)乔€(xiàn)Fig. 3 Time course of OD620, pH and residual sugars by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

圖4 原始菌 (A) 和S3 (B) 的發(fā)酵生產(chǎn)溶劑及有機(jī)酸曲線(xiàn)Fig. 4 Time course of solvents and acids production by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

圖5 原始菌和S3的ORP曲線(xiàn)Fig. 5 Time course of ORP by C. acetobutylicum L7 and S3 strain. ORP: oxidoreduction potential.

丁醇發(fā)酵分為兩個(gè)時(shí)期：產(chǎn)酸期，菌體快速生長(zhǎng)，產(chǎn)生有機(jī)酸 (乙酸和丁酸)，pH降低；產(chǎn)溶劑期，菌體代謝相對(duì)緩慢，溶劑 (丙酮、丁醇和乙醇) 大量生成，并伴隨乙酸和丁酸的重吸收，pH緩慢升高。發(fā)酵過(guò)程中，菌體為維持自身代謝，消耗大量的葡萄糖。如圖3和圖4所示，S3和原始菌在產(chǎn)酸期代謝旺盛，生物量 OD620快速增加；14 h左右，二者pH降到最低，即pH拐點(diǎn)，此時(shí)S3的pH值 (4.3) 和原始菌的 (4.2)相當(dāng)，發(fā)酵液中積累乙酸的量分別為2.01 g/L、2.05 g/L；丁酸2.06 g/L、2.13 g/L，為發(fā)酵過(guò)程中酸積累的最大濃度。之后有機(jī)酸毒性顯現(xiàn)，C. acetobutylicum開(kāi)始酸的重吸收，酸濃度降低，溶劑快速生成，pH升高。隨著發(fā)酵進(jìn)行，S3和原始菌OD620達(dá)到最大，分別為3.18、3.19，此時(shí)51.4%的葡萄糖已被消耗。之后10 h, 溶劑繼續(xù)生成，丁醇毒性開(kāi)始發(fā)揮作用，菌體OD620下降；此階段 S3和原始菌分別產(chǎn)生 3.78 g/L、2.26 g/L的丁醇，S3優(yōu)勢(shì)比較明顯。隨著丁醇濃度的增加，毒性進(jìn)一步加大，加上營(yíng)養(yǎng)匱乏，菌體代謝停止，發(fā)酵結(jié)束，各溶劑產(chǎn)量達(dá)到最大。

微生物代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生和消耗氧化還原力：NAD(P) 與 NAD(P)H，且胞內(nèi) NAD(P)/ NAD(P)H水平與菌體代謝和溶劑產(chǎn)生緊密相關(guān)[16-18]。氧化還原電位 (ORP) 是發(fā)酵體系氧化-還原性的外在反映[19]。分析原始菌和S3的發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn) ORP變化與菌體生長(zhǎng)、有機(jī)酸產(chǎn)生和重吸收、溶劑生成、pH變化密切偶聯(lián)。如圖3~5所示，菌體生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生大量有機(jī)酸，pH快速下降；同時(shí)產(chǎn)生大量能量和NAD(P)H，ORP隨之降低。當(dāng)有機(jī)酸積累到一定程度，毒性顯現(xiàn)，其分子態(tài)形式可以透過(guò)細(xì)胞膜，自由進(jìn)入菌體產(chǎn)生解偶聯(lián)毒害作用[20-21]。于是開(kāi)啟酸的重吸收通路，溶劑大量生成，有機(jī)酸濃度下降，pH緩慢升高，ORP趨向穩(wěn)定。隨丁醇濃度的增加，細(xì)胞代謝受到抑制，菌體加速死亡，ORP升高至發(fā)酵結(jié)束。ORP在發(fā)酵全程伴隨菌體生理代謝發(fā)生響應(yīng)變化[16]。發(fā)酵前24 h，S3的ORP表觀(guān)響應(yīng)更為迅速，在?493 mV至?470 mV之間變化，浮動(dòng)較大；隨后的15 h內(nèi)，其維持在?490 mV左右，相比原始菌，此階段還原力依然較強(qiáng)，產(chǎn)生5.52 g/L丁醇，而原始菌只生成 3.15 g/L，說(shuō)明在產(chǎn)溶劑期為主的生理代謝階段，S3迅速積累溶劑丁醇，并具有更高的代謝通量，與 ORP的階段性穩(wěn)定 (?490 mV狀態(tài)下) 存在一定的關(guān)聯(lián)性。針對(duì)C. acetobutylicum進(jìn)行ORP調(diào)控以提高菌體發(fā)酵性能的研究已有報(bào)道[22]，全程控制ORP有利于菌體提前進(jìn)入溶劑期，溶劑產(chǎn)量提高，發(fā)酵時(shí)間縮短，且 ORP的有效調(diào)控將改變細(xì)胞的代謝流及生理過(guò)程。本研究通過(guò)核糖體工程選育的菌株S3，其發(fā)酵過(guò)程O(píng)RP變化與丁醇代謝通量亦存在明顯關(guān)聯(lián)，暗示若ORP控制在?490 mV，菌體丁醇代謝通量極有可能進(jìn)一步提高。

對(duì)S3與C. acetobutylicum L7發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，消耗糖濃、各溶劑產(chǎn)量及丁醇/糖等參數(shù)進(jìn)行了比較 (表3)。

表3 S3與原始菌的比較Table 3 The comparison of S3 with C. acetobutylicum L7

C. acetobutylicum發(fā)酵產(chǎn)生3種溶劑：丙酮(A)、丁醇 (B) 和乙醇 (E)。發(fā)酵終點(diǎn)，A、B、E三者比例一般在3∶6∶1左右。表3數(shù)據(jù)顯示，S3和原始菌的 A/B/E比例相差不大；生長(zhǎng)過(guò)程中消耗的葡萄糖和最大生物量OD620基本相同，而最終S3生成的丁醇和乙醇比原始菌高，分別提高11.2% (1.26 g/L)、50% (0.57 g/L)，丙酮相差很小，總?cè)軇┫鄳?yīng)提高9.7% (1.79 g/L)；丁醇/糖轉(zhuǎn)化率由原始菌的0.19提高到0.22。S3發(fā)酵結(jié)束用時(shí)52 h，相比原始菌少9 h，發(fā)酵周期縮短，而產(chǎn)生的丁醇較多，說(shuō)明S3丁醇的生產(chǎn)效率較高，達(dá)到 0.24 g/(L·h)，相比提高 30.5%；因此S3在發(fā)酵中將更有優(yōu)勢(shì)，可以產(chǎn)生較多的溶劑，其經(jīng)濟(jì)可行性得到提高。整個(gè)丁醇發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸的重吸收與溶劑產(chǎn)生相偶聯(lián)。S3與原始菌有機(jī)酸的重吸收量分別為2.70 g/L、2.89 g/L，相差不大；二者丙酮產(chǎn)量基本相同，而S3的丁醇與乙醇總產(chǎn)量相比原始菌高1.83 g/L，可以推測(cè)S3的丁醇與乙醇代謝通量有可能發(fā)生了變化。生成丁醇與乙醇的途徑中，丁醇脫氫酶和乙醇脫氫酶是兩個(gè)關(guān)鍵酶，且相互關(guān)聯(lián)；二者結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變或活性增強(qiáng)，是否為核糖體工程作用的靶點(diǎn)，有待于下一步進(jìn)行研究確定。

丁醇發(fā)酵后期，發(fā)酵液里存有大量菌體和一些其他物質(zhì)，例如金屬離子、無(wú)機(jī)鹽、菌體自溶產(chǎn)生的蛋白、多糖、核酸等，致使發(fā)酵液具有一定的粘性，影響了整個(gè)發(fā)酵體系的傳質(zhì)傳熱，并增加攪拌的能量消耗[23]。若粘度較大，發(fā)酵效果和設(shè)備利用率將降低，不利于后續(xù)工作的進(jìn)行，增加溶劑分離的難度。對(duì)S3發(fā)酵液的粘度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其粘度由原始菌的 10 mPa·s減小到4 mPa·s，降低了 60%；這將便于溶劑分離和發(fā)酵工作的展開(kāi)，從而減少發(fā)酵成本。

2.4 S3與C. acetobutylicum L7的丁醇耐性

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)生物燃料時(shí)例如乙醇、1-丙醇等，目標(biāo)產(chǎn)物通常會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生很大的毒害作用，影響菌體生長(zhǎng)。丁醇發(fā)酵中，丁醇因其疏水性 (離液序列高) 堆積在細(xì)胞膜表面，干擾膜功能，其通透性和流動(dòng)性增加，使ATP、離子、磷脂、RNA、蛋白等流失，破壞適合菌體生長(zhǎng)的pH，影響胞內(nèi)新陳代謝和能量的運(yùn)輸及轉(zhuǎn)換，加速了菌體的死亡[5,24-25]。丁醇的毒性作用限制了發(fā)酵液中丁醇的濃度，增加后期的分離成本。因此對(duì)S3的丁醇耐性進(jìn)行了考察，如圖6所示不同丁醇濃度下 (0、6、12、14 g/L)，C. acetobutylicum L7與S3菌體的生長(zhǎng)情況。

圖6 不同丁醇濃度下原始菌與S3的生長(zhǎng)情況Fig. 6 Growth profles of C. acetobutylicum L7 and S3 challenged with different concentration of butanol. (A) 0 g/L butanol. (B) 6 g/L butanol. (C) 12 g/L butanol. (D) 14 g/L butanol.

從圖中可以看出，在添加丁醇的情況下，S3的生長(zhǎng)均強(qiáng)于原始菌，同時(shí)間點(diǎn)OD620一直較原始菌大，表現(xiàn)出較強(qiáng)的丁醇耐受力。原始菌在12 g/L丁醇中，起初能夠維持生長(zhǎng)，最大OD620為1.39；之后因其丁醇耐受低，菌體大量死亡。在添加14 g/L丁醇濃度下，S3菌體OD620緩慢增加，最大為 1.41；而原始菌無(wú)法存活，OD620一直減小，得出S3的丁醇耐受濃度比原始菌高，分別為14 g/L和12 g/L。

丁醇對(duì)C. acetobutylicum的毒害作用相當(dāng)嚴(yán)重。無(wú)丁醇的培養(yǎng)基中，原始菌和S3生長(zhǎng)良好，最大OD620各為2.43、2.46；含有丁醇的情況下，原始菌與S3的生長(zhǎng)受到明顯抑制，菌體增殖緩慢，最大OD620都未能達(dá)到2.4；并且4種丁醇濃度下，出現(xiàn)正增殖的時(shí)間逐漸縮短，分別為：原始菌12 h，12 h，6 h，0；S3 15 h，15 h，9 h，6 h。在耐受丁醇極限濃度下 (原始菌 12 g/L，S3 14 g/L)，OD620只能增殖到1.40，比無(wú)丁醇濃度下減小42.9%?？梢缘贸?，丁醇毒性嚴(yán)重影響了菌體的生長(zhǎng)代謝。文獻(xiàn)指出[26-27]，丁醇作用下，菌體細(xì)胞膜的組成發(fā)生很大改變；菌體不能維持內(nèi)部pH，ATPase活性降低。基于此，下一步可對(duì)S3進(jìn)行丁醇耐性機(jī)理的探索，并提出提高丁醇耐受程度的策略，為進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究首次使用鏈霉素誘變 C. acetobutylicum L7提高丁醇產(chǎn)量。篩選獲得的菌株，丁醇產(chǎn)量提高率均超過(guò)10%；其中S3產(chǎn)量最高，達(dá)到12.48 g/L，丁醇耐受程度也有顯著提高，表明核糖體工程技術(shù)在篩選丁醇高產(chǎn)菌株方面有效、可行。通過(guò)分析比較 S3與C. acetobutylicum L7發(fā)酵性能差異，推測(cè)S3的丁醇及乙醇代謝通量有可能發(fā)生變化，后續(xù)研究工作將對(duì)菌株S3的抗性突變、丁醇耐受機(jī)理及代謝通路作進(jìn)一步的研究，為更大程度提高丁醇產(chǎn)能提供技術(shù)支持。

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