還曉靜，李坤，史鋒，王小元

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

工業(yè)生物技術(shù)

谷氨酸棒桿菌NAD激酶的過(guò)表達(dá)對(duì)L-異亮氨酸合成的促進(jìn)作用

還曉靜1,2，李坤1,2，史鋒1,2，王小元1,2

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

NAD激酶催化輔酶Ⅰ[NAD(H)]發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)變成輔酶 Ⅱ[NADP(H)]，而還原態(tài)輔酶Ⅱ (NADPH) 是L-異亮氨酸合成的必要輔因子。為了提高NADPH的供應(yīng)，首先克隆了谷氨酸棒桿菌NAD激酶基因ppnK，并利用大腸桿菌-棒狀桿菌誘導(dǎo)型穿梭表達(dá)載體pDXW-8和組成型穿梭表達(dá)載體pDXW-9在L-異亮氨酸合成菌——乳糖發(fā)酵短桿菌JHI3-156中進(jìn)行表達(dá)。搖瓶發(fā)酵后，ppnK誘導(dǎo)表達(dá)菌JHI3-156/pDXW-8-ppnK的NAD激酶酶活 (4.33±0.74 U/g) 比pDXW-8空載菌提高了83.5%，輔酶Ⅱ與輔酶Ⅰ的比例提高了63.8%，L-異亮氨酸產(chǎn)量 (3.86±0.12 g/L) 提高了82.9%；ppnK組成表達(dá)菌JHI3-156/pDXW-9-ppnK的NAD激酶酶活 (7.67±0. 65 U/g)比pDXW-9空載菌提高了2.20倍，輔酶Ⅱ與輔酶Ⅰ的比例提高了1.34倍，NADPH含量提高了21.7%，L-異亮氨酸產(chǎn)量 (2.99±0.18 g/L) 提高了41.7%。這說(shuō)明NAD激酶有助于輔酶Ⅱ的供應(yīng)和L-異亮氨酸的生物合成，這對(duì)于其他氨基酸的生產(chǎn)也有一定的參考依據(jù)。

L-異亮氨酸，NAD激酶，誘導(dǎo)型表達(dá)，組成型表達(dá)，乳糖發(fā)酵短桿菌

Abstract:NAD kinase catalyzes the phosphorylation of coenzyme Ⅰ [NAD(H)] to form coenzyme Ⅱ [NADP(H)], and NADPH is an important cofactor in L-isoleucine biosynthesis. In order to improve NADPH supply,ppnK, the gene encoding NAD kinase inCorynebacterium glutamicumwas cloned and separately expressed in an L-isoleucine synthetic strain,Brevibacterium lactofermentumJHI3-156, by an inducible expression vector pDXW-8 and a constitutive expression vector pDXW-9. Compared with the control strain JHI3-156/pDXW-8, NAD kinase activity of the inducibleppnK-expressing strain JHI3-156/pDXW-8-ppnKwas increased by 83.5%. NADP(H)/NAD(H) ratio was also increased by 63.8%. L-isoleucine biosynthesis was improved by 82.9%. Compared with the control strain JHI3-156/pDXW-9, NAD kinase activity of the constitutiveppnK-expressing strain JHI3-156/pDXW-9-ppnKwas increased by 220%. NADP(H)/NAD(H) ratio and NADPH concentration were increased by 134% and 21.7%, respectively. L-isoleucine biosynthesis was increased by 41.7%. These results demonstrate that NAD kinase can improve the coenzyme Ⅱ supply and L-isoleucine biosynthesis, which would also be useful for biosynthesis of other amino acids.

Keywords:L-isoleucine, NAD kinase, inducible expression, constitutive expression,Brevibacterium lactofermentum

L-異亮氨酸 (L-isoleucine，Ile) 是高等動(dòng)物的8種必需氨基酸之一，世界衛(wèi)生組織建議體重為70 kg的成年人每日攝取1.4 g。L-異亮氨酸在飼料[1]、食品、醫(yī)藥[2]行業(yè)的應(yīng)用非常廣泛，用量逐年增長(zhǎng)[3]。在國(guó)內(nèi)，工業(yè)上大多采用誘變篩選獲得的菌株通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸，產(chǎn)品得率及質(zhì)量都難以參與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)，生產(chǎn)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需求。

應(yīng)用基因工程手段進(jìn)行生產(chǎn)菌的定向育種，能打破種屬界限，集中不同菌株的優(yōu)點(diǎn)，從而選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的基因工程菌[4-5]。L-異亮氨酸的合成從天冬氨酸開(kāi)始，涉及 10步反應(yīng)。除了可以通過(guò)改造合成途徑的關(guān)鍵酶[6-7]之外，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)輔酶的供應(yīng)來(lái)對(duì) L-異亮氨酸的合成途徑進(jìn)行分子改造。L-異亮氨酸合成所需的關(guān)鍵輔酶是 NADPH，它是天冬氨酸 β-半醛脫氫酶(ASD)、高絲氨酸脫氫酶 (HD) 和乙酰羥酸合酶(AHAIR) 的輔酶。NADPH還是細(xì)胞內(nèi)最重要的還原力，在還原性生物合成中起到氫供體的作用，高效供應(yīng)NADPH有利于發(fā)揮菌株的合成潛力[8-9]，推動(dòng)L-異亮氨酸的進(jìn)一步積累。

圖1 輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of coenzyme Ⅰ and Ⅱ.

細(xì)胞內(nèi)NADPH的主要供應(yīng)渠道是HMP途徑和NAD激酶，其中HMP途徑利用氧化態(tài)輔酶Ⅱ(NADP+) 作為電子受體生成還原態(tài)輔酶Ⅱ(NADPH)，NAD激酶則催化輔酶Ⅰ發(fā)生磷酸化生成輔酶Ⅱ(圖1)。HMP途徑在產(chǎn)生NADPH的同時(shí)，會(huì)消耗其他底物，如葡萄糖[10-11]；而NAD激酶則只調(diào)節(jié)輔酶的轉(zhuǎn)變，不消耗其他碳源底物。NAD激酶包括NAD+激酶和NADH激酶，NAD+激酶利用 ATP或多聚磷酸鹽[poly(P)]作為磷酸供體，催化NAD+發(fā)生磷酸化，生成NADP+；而NADH激酶則催化NAD+和NADH發(fā)生磷酸化，生成NADP+和NADPH[12]。NAD激酶催化的反應(yīng)構(gòu)成了NADP+生物合成途徑的最后一步，是生物細(xì)胞內(nèi)唯一一種催化 NAD(H) 生成NADP(H) 的反應(yīng)。近年來(lái)，對(duì)NAD激酶的分子基礎(chǔ)研究表明絕大多數(shù)生物體內(nèi)都存在NAD激酶[13]，它具有重要的生理功能。在氨基酸的主要生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌中，存在一種利用 ATP和poly(P) 作為磷酸供體，催化NAD+和NADH發(fā)生磷酸化的NAD激酶，即poly(P)/ATP-NAD激酶 (PpnK)。最近Lindner等在L-賴(lài)氨酸生成菌中表達(dá)PpnK，研究顯示其有利于L-賴(lài)氨酸積累[14]。

目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用基因工程手段來(lái)選育 L-異亮氨酸生成菌的研究已初步開(kāi)展，但還未研究利用輔酶調(diào)控技術(shù)來(lái)提高其產(chǎn)量。L-異亮氨酸的生產(chǎn)菌株多以親緣關(guān)系相近的谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum[15]和乳糖發(fā)酵短桿菌Brevibacterium lactofermentum[16]為主。本文通過(guò)克隆谷氨酸棒桿菌的ppnK基因，并在一株L-異亮氨酸合成菌——乳糖發(fā)酵短桿菌 JHI3-156中表達(dá)，研究了它對(duì)胞內(nèi)輔酶供應(yīng)和對(duì)L-異亮氨酸積累的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)中所用到的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中添加20 g/L的瓊脂粉，需要時(shí)，添加50 mg/L卡那霉素。

LBG培養(yǎng)基：在 LB 培養(yǎng)基中添加50 g/L葡萄糖，需要時(shí)，添加30 mg/L卡那霉素。

活化培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中添加50 g/L葡萄糖和50 g/L牛肉浸膏，相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中添加15 g/L的瓊脂粉，需要時(shí)，添加30 mg/L卡那霉素。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，尿素1.25 g/L，玉米漿20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0，需要時(shí)，添加30 mg/L卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，(NH4)2SO420 g/L，玉米漿20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L和CaCO320 g/L，pH 6.7，需要時(shí)，添加30 mg/L卡那霉素。攜帶誘導(dǎo)型表達(dá)載體的重組菌株，在發(fā)酵接種后10 h添加IPTG (終濃度為1 μmol/L) 誘導(dǎo)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)和ppnK基因的擴(kuò)增

根據(jù) NCBI中報(bào)道的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的ppnK基因 (GenBank Accession No. Cg1601) 設(shè)計(jì)上游引物ppnK(F) 和下游引物ppnK(R)，引物序列見(jiàn)表2。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究使用的PCR引物Table 2 PCR primers used in this study

將谷氨酸棒桿菌ATCC13032用LBG培養(yǎng)基在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，收集3 mL細(xì)胞，提取其基因組。以該基因組 DNA為模板、ppnK(F) 和ppnK(R) 為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ片段。

1.2.2 重組質(zhì)粒和工程菌株的構(gòu)建

純化后的PCR產(chǎn)物NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ用NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，分別定向連接至大腸桿菌/棒狀桿菌誘導(dǎo)型表達(dá)載體 pDXW-8[17]和組成型表達(dá)載體pDXW-9[18]，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子 DH5α/pDXW-8-ppnK和 DH5α/pDXW-9-ppnK。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提交上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

參照文獻(xiàn)方法[17]制備乳糖發(fā)酵短桿菌JHI3-156感受態(tài)細(xì)胞。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pDXW-8、pDXW-9、pDXW-8-ppnK和pDXW-9-ppnK用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入JHI3-156感受態(tài)細(xì)胞，于LBHIS培養(yǎng)基[17]中培養(yǎng)72 h，挑取轉(zhuǎn)化子，得到ppnK表達(dá)菌株和空載菌株。

1.2.3 重組菌株的發(fā)酵

取出發(fā)菌株 JHI3-156和重組菌株在活化平板上劃線(xiàn)，于30 ℃培養(yǎng)24 h。挑一滿(mǎn)環(huán)活化平板上的菌體接種至50 mL種子培養(yǎng)基 (250 mL錐形瓶) 中，在30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。種子液按終濃度OD562=1.0的接種量轉(zhuǎn)接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(500 mL錐形瓶)，在30 ℃、200 r/min發(fā)酵72 h。進(jìn)行了兩批發(fā)酵，每批每株菌株設(shè)3個(gè)平行樣，所有結(jié)果為這2批發(fā)酵的平均值。

發(fā)酵開(kāi)始后，每隔6 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液菌體濃度和葡萄糖含量。測(cè)定葡萄糖含量時(shí)，取1 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min得到發(fā)酵上清液，稀釋100倍后，用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.4 NAD激酶酶活的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體，用 KNDE緩沖液(1.0 mmol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 7.0，0.1 mmol/L NAD+，0.5 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA) 洗滌3次，加入10 mL KNDE緩沖液重懸細(xì)胞，加入100 μL溶菌酶 (100 g/L) 處理后，在冰水里超聲波破碎2 h，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，收集上清。上清中蛋白質(zhì)含量用Bradford法在核酸-蛋白定量?jī)x (GeneQuant公司) 上測(cè)定。ATP-NAD+激酶的酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[19]，測(cè)定吸光度值OD340變化。酶活定義為：在30 ℃、1 mL反應(yīng)體系中，每分鐘催化得到1 μmol NADP+的酶量為1 U，比酶活用U/mg或U/g表示。

1.2.5 NAD(H)和NADP(H)濃度的測(cè)定

發(fā)酵24 h時(shí)，取1 mL發(fā)酵液2份，離心去上清，菌體置于液氮急速淬滅后存放于-70 ℃冰箱。測(cè)定輔酶含量時(shí)，取出菌體，置于冰水混合物中用冷的PBS (pH 7.5) 清洗1次，然后參照文獻(xiàn)方法[20]測(cè)定 4種輔酶 NAD+、NADH、NADP+、NADPH含量。細(xì)胞干重按經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：Y (g/L DCW) =0.6495×OD562?2.7925；細(xì)胞體積按每mg DCW為1.6 μL計(jì)算。

1.2.6 氨基酸含量的測(cè)定

發(fā)酵過(guò)程中，每隔6 h取1 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min得到發(fā)酵上清液，用5%三氯乙酸稀釋50倍，靜置1 h，12 000 r/min離心10 min得到上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜系統(tǒng) (Agilent公司1200series色譜儀) 自動(dòng)柱前衍生化法測(cè)定氨基酸含量。色譜柱：Agilent Eclipse-AAA柱。流動(dòng)相水相(1 L)：4.52 g無(wú)水乙酸鈉、200 μL三乙胺、5 mL四氫呋喃、pH 7.2；有機(jī)相 (1 L)：4.52 g無(wú)水乙酸鈉、400 mL甲醇、400 mL乙腈。色譜條件：柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，DAD檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1ppnK表達(dá)質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

以谷氨酸棒桿菌 ATCC13032基因組為模板，通過(guò) PCR擴(kuò)增得到 1 002 bp的NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ基因片段，分別連入 9 548 bp的pDXW-8和8 351 bp的pDXW-9表達(dá)載體中構(gòu)建ppnK表達(dá)質(zhì)粒。

pDXW-8為大腸桿菌-棒狀桿菌誘導(dǎo)型穿梭表達(dá)載體，該載體使用lacIPF104控制的tac啟動(dòng)子和rrnBT1T2終止子來(lái)控制插入基因的表達(dá)[17]。pDXW-9是大腸桿菌-棒狀桿菌組成型穿梭表達(dá)載體，該載體使用tac啟動(dòng)子和rrnBT1T2終止子來(lái)控制目的基因的表達(dá)[18]。

將基因片段NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ和表達(dá)載體pDXW-8或pDXW-9用限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用 T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到 DH5α/pDXW-8-ppnK和 DH5α/pDXW-9-ppnK轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)HindⅢ單酶切和ppnK基因擴(kuò)增、測(cè)序，證明構(gòu)建得到10 488 bp的pDXW-8-ppnK和9 291bp的pDXW-9-ppnK重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒pDXW-8-ppnK和pDXW-9-ppnK電轉(zhuǎn)化乳糖發(fā)酵短桿菌JHI3-156，得到JHI3-156/pDXW-8-ppnK和 JHI3-156/pDXW-9-ppnK轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通過(guò)Hind Ⅲ單酶切和ppnK基因擴(kuò)增，證明構(gòu)建得到 JHI3-156/pDXW-8-ppnK和JHI3-156/pDXW-9-ppnK重組菌株。將空載體pDXW-8和 pDXW-9轉(zhuǎn)化 JHI3-156，得到JHI3-156/pDXW-8和 JHI3-156/pDXW-9空載菌株。

2.2 重組菌的搖瓶發(fā)酵

將構(gòu)建的 4株重組菌 JHI3-156/pDXW-8、JHI3-156/pDXW-9、JHI3-156/pDXW-8-ppnK、JHI3-156/pDXW-9-ppnK與出發(fā)菌JHI3-156進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)狀況、NAD激酶表達(dá)情況和 ATP-NAD+激酶酶活、輔酶含量以及L-異亮氨酸產(chǎn)量。通過(guò)比較各菌株的發(fā)酵性能差異，分析誘導(dǎo)型和組成型表達(dá) NAD激酶對(duì)L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。

2.2.1 重組菌的生長(zhǎng)情況

搖瓶發(fā)酵72 h，各菌株的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。發(fā)酵過(guò)程中ppnK表達(dá)菌和出發(fā)菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好，36 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，之后菌體緩慢增長(zhǎng)。出發(fā)菌 JHI3-156在無(wú)抗生素和誘導(dǎo)劑的條件下培養(yǎng)，生長(zhǎng)最好，72 h時(shí)OD562值達(dá)到26.8±1.8，而pDXW-8和 pDXW-9空載菌則因攜帶了質(zhì)粒生長(zhǎng)減緩。ppnK的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)不良影響，72 h時(shí)OD562為 24.9±0.8，比空載菌株JHI3-156/pDXW-8 (18.9±0.3) 提高了 31.7%。ppnK組成型表達(dá)對(duì)菌體的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用，72 h時(shí)OD562為25.0±0.5，比空載菌株JHI3-156/pDXW-8 (20.4±0.2) 提高了 22.5%，說(shuō)明 NAD激酶的表達(dá)有助于細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2.2 重組菌的胞內(nèi)NAD激酶酶活

谷氨酸棒桿菌的 PpnK是一種利用 ATP和poly(P) 作為磷酸供體，催化NAD+和NADH (輔酶Ⅰ) 發(fā)生磷酸化生成NADP+和NADPH (輔酶Ⅱ) 的NAD激酶。各菌株發(fā)酵72 h后細(xì)胞破碎液上清中ATP-NAD+激酶的活性如圖3所示。而它們的ATP-NADH激酶活性很低。

圖2 乳糖發(fā)酵短桿菌搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Cell growth of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains.

在出發(fā)菌和兩株空載菌中ATP-NAD+激酶的酶活力較低，而在ppnK表達(dá)菌中，酶活顯著提高，其中ppnK組成型表達(dá)菌的ATP-NAD+激酶酶活 (7.67±0.65 U/g) 比 pDXW-9空 載 菌(2.40±0.23 U/g) 提高了2.20倍，ppnK誘導(dǎo)型表達(dá)菌的酶活 (4.33±0.74 U/g) 比pDXW-8空載菌(2.36±0.72 U/g) 提高了83.5%，說(shuō)明ppnK基因的表達(dá)提高了細(xì)胞內(nèi)NAD激酶活力。

2.2.3 重組菌的胞內(nèi)輔酶含量

由于6～36 h是菌體的快速生長(zhǎng)期 (圖2)，而JHI3-156/pDXW-8-ppnK在發(fā)酵10 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于是我們檢測(cè)了發(fā)酵24 h時(shí)各菌株胞內(nèi)的4種輔酶含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 發(fā)酵菌株細(xì)胞內(nèi)的ATP-NAD+激酶活性Fig.3 ATP-NAD+kinase activities of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains.

表3 乳糖發(fā)酵短桿菌發(fā)酵24 h時(shí)的細(xì)胞內(nèi)輔酶含量Table 3 Intracellular NAD+, NADH, NADP+, and NADPH concentrations of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains after fermentation for 24 h

由表3可知：發(fā)酵24 h，ppnK誘導(dǎo)表達(dá)菌的細(xì)胞內(nèi) NADP+濃度比 pDXW-8空載菌高80.9%，輔酶Ⅱ(NADP++NADPH) 與輔酶Ⅰ(NAD++NADH) 的比例比空載菌高63.8%，比出發(fā)菌JHI3-156高1.80倍；ppnK組成型表達(dá)菌的細(xì)胞內(nèi)NADP+濃度比pDXW-9空載菌高88.0%，NADPH濃度比空載菌高21.7%，而輔酶Ⅱ與輔酶Ⅰ的比例比空載菌高1.34倍，比JHI3-156高2.56倍。說(shuō)明在發(fā)酵24 h時(shí)，重組菌中ppnK基因的過(guò)量表達(dá)和NAD激酶酶活的提高促進(jìn)了胞內(nèi)輔酶Ⅱ的合成，其中ppnK基因的組成型表達(dá)更有利于提高細(xì)胞內(nèi)NADP+與NADPH的供應(yīng)。

2.2.4 重組菌發(fā)酵后的氨基酸含量

最后我們檢測(cè)了發(fā)酵過(guò)程中重組菌和出發(fā)菌的發(fā)酵液中葡萄糖和 L-異亮氨酸含量變化(圖 4)。

圖4 乳糖發(fā)酵短桿菌搖瓶發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)Fig.4 Process curves of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains. (A) Concentration of glucose. (B) Concentration of L-isoleucine.

從圖4中可以看出，5株菌株消耗葡萄糖的規(guī)律是基本一致的，在發(fā)酵過(guò)程的12～48 h快速消耗葡萄糖；5株菌株的L-異亮氨酸積累進(jìn)程則存在較大差異，在發(fā)酵12 h前各個(gè)菌株僅合成少量的L-異亮氨酸，在18 h后，添加誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)表達(dá)菌的 L-異亮氨酸合成速率開(kāi)始高于其他菌株，在24 h后產(chǎn)量開(kāi)始明顯增加，而在36 h后組成型表達(dá)菌也開(kāi)始以較快的速度積累 L-異亮氨酸。在發(fā)酵72 h后，ppnK誘導(dǎo)表達(dá)菌的L-異亮氨酸產(chǎn)量 (3.86±0.12 g/L) 比pDXW-8空載菌 (2.11±0.21 g/L) 提高了82.9%，而ppnK組成型表達(dá)菌的L-異亮氨酸產(chǎn)量 (2.99±0.18 g/L) 比pDXW-9空載菌 (2.11±0.23 g/L) 提高了41.7%，且分別比出發(fā)菌 JHI3-156 (2.08±0.20 g/L) 提高了85.6%和43.8%，說(shuō)明通過(guò)表達(dá)ppnK基因來(lái)提高胞內(nèi)NADP+和NADPH的供應(yīng)有利于L-異亮氨酸的積累。與空載菌和出發(fā)菌相比，ppnK表達(dá)菌的糖酸轉(zhuǎn)化率也顯著提高，尤其是ppnK誘導(dǎo)表達(dá)菌 (0.0719 g/g) 比出發(fā)菌 (0.0377 g/g)和空載菌 (0.0370 g/g) 分別提高了 90.7%和94.3%，而ppnK組成表達(dá)菌 (0.0534 g/g) 比出發(fā)菌和空載菌 (0.0358 g/g) 分別提高了 41.6%和49.2%。ppnK表達(dá)菌的異亮氨酸產(chǎn)率 (異亮氨酸產(chǎn)量/細(xì)胞干重) 也得到一定程度的提高。ppnK誘導(dǎo)表達(dá)菌為 0.289 g/g，組成表達(dá)菌為0.222 g/g，都比出發(fā)菌JHI3-156 (0.142 g/g) 有了較大的提高，但與對(duì)應(yīng)的空載菌 JHI3-156/pDXW-8 (0.223 g/g) 和 JHI3-156/pDXW-9(0.201 g/g) 相比，提高幅度分別降至 29.6%和10.4%，這與空載菌生長(zhǎng)速率較慢有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了 2個(gè)重組質(zhì)粒 pDXW-8-ppnK和pDXW-9-ppnK以及4株重組乳糖發(fā)酵短桿菌JHI3-156/pDXW-8，JHI3-156/pDXW-9，JHI3-156/pDXW-8-ppnK和JHI3-156/pDXW-9-ppnK。搖瓶發(fā)酵時(shí)，雖然2株空載菌的生長(zhǎng)速率略微降低，但2株ppnK基因表達(dá)菌的菌體生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說(shuō)明 NAD激酶的表達(dá)有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。與JHI3-156/pDXW-8相比，ppnK誘導(dǎo)表達(dá)菌的胞內(nèi) ATP-NAD+激酶的酶活提高了 83.5%，發(fā)酵24 h時(shí)胞內(nèi)NADP+濃度提高了80.9%，NADPH濃度提高了21.7%，輔酶Ⅱ與輔酶Ⅰ的比例提高了63.8%，最終L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了82.9%。與JHI3-156/pDXW-9相比，ppnK組成型表達(dá)菌的胞內(nèi)ATP-NAD+激酶的酶活提高了2.20倍，發(fā)酵24 h時(shí)胞內(nèi)NADP+濃度提高了88.0%，輔酶Ⅱ與輔酶Ⅰ的比例提高了 1.34倍，最終 L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了41.7%。2株重組菌的異亮氨酸產(chǎn)量、產(chǎn)率和得率都高于出發(fā)菌株。

這些結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)谷氨酸棒桿菌NAD激酶，能夠提高發(fā)酵細(xì)胞內(nèi)輔酶Ⅱ的含量，為L(zhǎng)-異亮氨酸的合成提供更為充足的必需還原力，推動(dòng)L-異亮氨酸積累，同時(shí)也抵消了負(fù)荷載體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的不利影響。與ppnK的誘導(dǎo)表達(dá)相比，雖然ppnK的組成型表達(dá)更有利于輔酶Ⅱ的合成，但對(duì) L-異亮氨酸合成的促進(jìn)作用卻不如前者，一部分原因可能在于外源基因的組成型表達(dá)對(duì)細(xì)胞正常代謝造成影響，因?yàn)榫w在不同的生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)輔酶Ⅱ的需求量是不同的，而輔酶Ⅱ與輔酶Ⅰ的比例也對(duì)發(fā)酵進(jìn)程產(chǎn)生影響，組成型表達(dá)所產(chǎn)生的輔酶影響了菌體各個(gè)時(shí)期胞內(nèi)輔酶含量平衡，影響了細(xì)胞內(nèi)的代謝流向。

而本研究證明在細(xì)胞快速生長(zhǎng)到一定程度后再過(guò)量表達(dá)NAD激酶，有助于產(chǎn)生的輔酶Ⅱ更多地被L-異亮氨酸合成途徑所利用，從而達(dá)到更好的輔酶供應(yīng)調(diào)控效果。說(shuō)明在L-異亮氨酸合成時(shí)，雖然輔酶Ⅱ的積累有利于產(chǎn)量提高，但也應(yīng)根據(jù)代謝途徑對(duì)輔酶的形式和含量的動(dòng)態(tài)需求，通過(guò)調(diào)整NAD激酶表達(dá)的強(qiáng)度和表達(dá)的階段性等方面，來(lái)滿(mǎn)足L-異亮氨酸積累時(shí)所需要的輔酶量。對(duì)此，未來(lái)將進(jìn)行小試發(fā)酵罐的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定在良好的發(fā)酵環(huán)境下，兩株重組菌及對(duì)照菌株生長(zhǎng)、糖耗和產(chǎn)酸的情況，并進(jìn)行全面分析，希望能得到更有價(jià)值的結(jié)論。

本文報(bào)道了利用NAD激酶來(lái)提高乳糖發(fā)酵短桿菌的L-異亮氨酸產(chǎn)量。分析了誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)NAD激酶對(duì)發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)，NAD激酶酶活，輔酶含量和氨基酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，通過(guò)過(guò)量表達(dá)輔酶Ⅱ合成關(guān)鍵酶，有助于提高NADP(H) 的供應(yīng)，從而提高L-異亮氨酸產(chǎn)量，本研究為通過(guò)輔酶調(diào)控手段來(lái)提高合成途徑中NADPH的供應(yīng)，進(jìn)而運(yùn)用于氨基酸生產(chǎn)提供了一定的參考。

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Overexpression ofCorynebacterium glutamicumNAD kinase improves L-isoleucine biosynthesis

Xiaojing Huan1,2, Kun Li1,2, Feng Shi1,2, and Xiaoyuan Wang1,2

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China

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Received:December 21, 2011;Accepted:March 15, 2012

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870056).

Corresponding author:Feng Shi. Tel/Fax: +86-510-85329236; E-mail: shifeng@jiangnan.edu.cn

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