王曉鳳，張 建，辛秀娟，鮑 杰

華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛降解代謝分析

王曉鳳，張 建，辛秀娟，鮑 杰

華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

木質(zhì)纖維素在預(yù)處理過程產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對(duì)后續(xù)的酶水解和微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制。因此，這些抑制物的脫除即所謂的“脫毒”步驟是正常進(jìn)行后續(xù)酶解和發(fā)酵的前提條件。我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室篩選的絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛的代謝路徑進(jìn)行了研究。絲狀真菌A. resinae ZN1轉(zhuǎn)化糠醛的降解代謝途徑可以簡(jiǎn)述為：糠醛首先快速地轉(zhuǎn)化為毒性較低的糠醇；在有氧條件下，糠醇又再度生成不致對(duì)微生物產(chǎn)生危害的低濃度糠醛，糠醛繼續(xù)氧化為糠酸。推測(cè)糠酸可能繼續(xù)進(jìn)入TCA循環(huán)，進(jìn)而完成糠醛的完全降解。研究結(jié)果為將來加快絲狀真菌A. resinae ZN1生物脫毒速率、改善木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的限速步驟提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞: 降解途徑，生物脫毒，糠醛，木質(zhì)纖維素

在木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化過程中，預(yù)處理是破壞木質(zhì)纖維素致密結(jié)構(gòu)、提高纖維素酶解效率的必需步驟[1]。高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的預(yù)處理在破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的同時(shí)，不可避免地生成了多種對(duì)后續(xù)酶解和微生物發(fā)酵過程具有強(qiáng)烈抑制作用的降解產(chǎn)物，主要包括有機(jī)酸類化合物、呋喃類化合物和酚類化合物[2-6]，因此，要實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素的有效生物轉(zhuǎn)化，必須對(duì)預(yù)處理后的原料進(jìn)行脫毒處理。

目前常用的脫毒方法有水洗法[7]、過堿化處理 (Overliming)[8]、活性炭或離子交換樹脂吸附[9]、真空蒸發(fā)[2]以及生物降解等[10-13]。這些方法中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的僅有水洗法和過堿化方法，但都存在著大量耗水和大量廢水產(chǎn)生、物料損失嚴(yán)重、處理后物料高含水等嚴(yán)重問題[14]。與其他脫毒方法相比，生物脫毒法條件溫和、抑制物轉(zhuǎn)化徹底、耗能低且廢水少，而且脫毒后的物料可以直接進(jìn)入乙醇發(fā)酵，但脫毒效率低[15-16]是制約生物脫毒法廣泛應(yīng)用的核心問題。因此，得到一株能夠高效降解各種抑制物的微生物是生物脫毒法的關(guān)鍵[17]。

糠醛由于含有呋喃環(huán)，不易受到代謝過程的破壞，生物降解較為緩慢。Gerhard等從含有亞硫酸鹽的連續(xù)發(fā)酵罐中分離出了一株能夠轉(zhuǎn)化糠醛的菌株Desulfovibrio sp. F-1[18]。這株菌能夠在無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子受限制的硫酸鹽培養(yǎng)基中，以糠醛作為唯一的碳源和能源生長(zhǎng)，得率為1.6~1.8 mmol乙酸/mmol糠醛。Mohammad等對(duì)有氧及厭氧情況下的馴化釀酒酵母CBS 8066降解糠醛進(jìn)行了研究[19]，在有氧或者厭氧的分批發(fā)酵中，糠醛主要代謝為糠醇 (產(chǎn)率約為70%)，而且在指數(shù)期生長(zhǎng)期代謝能力最強(qiáng)，穩(wěn)定期較弱；糠醛使酵母的比生長(zhǎng)速率和乙醇產(chǎn)率下降，而當(dāng)糠醛完全代謝完后有所回升。Belay等對(duì)一株產(chǎn)甲烷球菌屬的突變株Methanococcus deltae LH厭氧轉(zhuǎn)化糠醛進(jìn)行了研究[20]，該菌株代謝糠醛的主要產(chǎn)物是糠醇，同時(shí)生成甲烷和二氧化碳?xì)怏w，但它不能以糠醛為唯一碳源及能源生長(zhǎng)。Nichols等從被糠醛污染過的土壤中分離到了一種可以代謝呋喃衍生物、有機(jī)酸以及酚類化合物的真菌Coniochaeta ligniaria NRRL30616，可以把毒性強(qiáng)的糠醛轉(zhuǎn)化為弱毒性的相應(yīng)醇的形式，即糠醇，然后再氧化為相應(yīng)的酸，從而使得酵母的后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇得以進(jìn)行[21]。

近兩年，荷蘭Delft University of Technology的一個(gè)研究組對(duì)糠醛的代謝路徑進(jìn)行了較為深入的研究。Wierckx等從土壤中分離獲得的Cupriavidus basilensis HMF14能夠代謝轉(zhuǎn)化5-羥甲基糠醛和糠醛，但卻不能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及甘露糖[22]；進(jìn)一步的代謝路徑研究表明，C. basilensis HMF14代謝糠醛的產(chǎn)物分別是糠醇和糠酸，并最終進(jìn)入支持細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝路徑；在這3種呋喃衍生物中，糠醛對(duì)微生物的毒性最大，因此在微生物轉(zhuǎn)化糠醛時(shí)，首先將它快速地轉(zhuǎn)化為糠醇，從而使糠醛含量保持在一個(gè)低水平濃度范圍內(nèi)，然后再分批少量地通過將其氧化為糠醛作為過渡階段，最終將其氧化為糠酸，通過細(xì)胞攝入，將糠酸大量地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中，支持菌體生長(zhǎng)，因此在這個(gè)過程中，糠醛、糠醇和糠酸是相互轉(zhuǎn)化的，且這個(gè)過程中只能看到少量的糠酸積累。Koopman等建立了C. basilensis HMF14的突變體轉(zhuǎn)座子文庫(kù)，鑒定出了呋喃衍生物代謝途徑涉及的基因，并在假單胞菌Pseudomonas putida體內(nèi)重構(gòu)了糠醛和5-羥甲基糠醛的代謝途徑[23]。

Zhang等從稀酸預(yù)處理后的玉米秸稈中篩選到了一株脫毒真菌Amorphotheca resinae ZN1，并對(duì)其作了分子生物學(xué)和微生物學(xué)鑒定，而且在玉米秸稈發(fā)酵乙醇過程中得到了有效利用[15]。本實(shí)驗(yàn)主要是以糠醛作為唯一碳源對(duì)這一煤油真菌A. resinae ZN1的抑制物代謝路徑進(jìn)行了研究。所提出的煤油真菌A. resinae ZN1轉(zhuǎn)化糠醛的降解代謝途徑跟前人提出的細(xì)菌中的代謝途徑基本一致，糠醛首先快速地轉(zhuǎn)化為毒性較低的糠醇，糠醇又再度生成不致對(duì)微生物產(chǎn)生危害的低濃度糠醛，糠醛繼續(xù)氧化為糠酸。推測(cè)糠酸的進(jìn)一步降解路徑可能與其他微生物類似[23]，通過進(jìn)入TCA循環(huán)完成糠醛的完全降解。研究結(jié)果對(duì)將來加快煤油真菌A. resinae ZN1生物脫毒速率、改善木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的限速步驟提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品

糠醛購(gòu)自上海德默化學(xué)技術(shù)有限公司 (上海，中國(guó))，糠醇和糠酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 (上海，中國(guó))。磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈣購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司(上海，中國(guó))，酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid Ltd (Basingstoke Hampshire，England)。所有試劑和藥品均為分析純。

1.2 脫毒菌株及培養(yǎng)

脫毒菌種為本實(shí)驗(yàn)室篩選和保存的Amorphotheca resinae ZN1，該菌的分子生物學(xué)和微生物學(xué)鑒定見文獻(xiàn)[8]。A. resinae ZN1菌株在PDA試管斜面保存和傳代。PDA培養(yǎng)基的制備簡(jiǎn)述：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL。煮沸l(wèi) h，用8層紗布過濾，然后補(bǔ)足水至1 L，并添加葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，121 ℃滅菌20 min，貯存?zhèn)溆谩Ｔ撆囵B(yǎng)基為菌株的傳代保存培養(yǎng)基。

1.3 A. resinae ZN1的培養(yǎng)和發(fā)酵

種子培養(yǎng)基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖40 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖20 g/L。滅菌后分別添加過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L。滅菌后加入過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。

發(fā)酵菌種的培養(yǎng)：用無菌水從培養(yǎng)好的PDA斜面試管洗下孢子懸液，然后按照10% (V/V)的接種量接入含有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱里靜止培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵操作是在3 L發(fā)酵罐 (保興生物科技有限公司，上海，中國(guó)) 中進(jìn)行的，裝液量為1 L，20% (V/V) 接種量，溫度26 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，并通過調(diào)節(jié)通氣量來控制不同的溶氧水平。在發(fā)酵過程中，用2 mol/L的HCl和NaOH維持發(fā)酵體系的pH在5.5，并不時(shí)取樣，取樣后立即用0.22 μm的濾膜過濾樣品，然后保存在4 ℃的冰箱，以備后續(xù)的分析。

1.4 分析方法

呋喃衍生物 (包括糠醛、糠醇、糠酸) 通過RP-HPLC (Reversed-phase HPLC，LC-20AT，UV/VIS detector SPD-20A；Shimadzu，Kyoto，Japan) 和GC-MS (QP5000，Shimadzu，Agilent 19091S-433) 進(jìn)行定性分析，并用RP-HPLC進(jìn)行定量分析。

RP-HPLC的配置和工作條件為：YMC-Pack ODS-A柱 (LC-20AT，UV/VIS detector SPD-20A；Shimadzu，Toyoto，Japan)，流動(dòng)相流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶超純水=50:50；檢測(cè)波長(zhǎng)為：糠醛、糠醇和糠酸為220 nm。

葡萄糖和乙酸是通過HPLC (LC-20AD，refractive index detector RID-10A；Shimadzu，Toyoto，Japan)測(cè)定的。HPLC的配置和工作條件為：Bio-Rad HPX-87H柱，流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸，柱溫為65 ℃流速為0.6 mL/min。所有從發(fā)酵罐中取的樣品，進(jìn)樣前均在14 000 r/min的條件下離心7 min，并通過0.22 μm的濾膜過濾。以上所有糠醛代謝過程均有兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 A. resinae ZN1以糠醛為唯一碳源的代謝轉(zhuǎn)化Fig. 1 Metabolism of furfural as the sole carbon source by A. resinae ZN1. Conditions: 20% incaution, 26 °C, pH 5.5, 100 r/min, ventilation of 0.91 vvm.

2 結(jié)果與分析

2.1 A. resinae ZN1的糠醛代謝分析

為了更清楚地了解A. resinae ZN1生物脫除糠醛的代謝路徑，也為了驗(yàn)證糠醛能否作為絲狀真菌A. resinae ZN1的唯一碳源，本研究采用了含糠醛的無糖無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基。種子擴(kuò)培后用500 mL的無菌水洗菌膜2次，將洗去殘?zhí)堑木そ臃N到含糠醛的無糖無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖1。該實(shí)驗(yàn)是采用的無糖無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基對(duì)A. resinae ZN1進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)情況來看，A. resinae ZN1依然可以很好地進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，從接種發(fā)酵開始到糠醛轉(zhuǎn)化期間，發(fā)酵罐內(nèi)從剛開始接種的少量菌片到發(fā)酵罐內(nèi)壁周圍貼滿黑色的成片狀菌絲、發(fā)酵罐攪拌槳上纏滿菌絲片，發(fā)酵液從初始的澄清透亮狀態(tài)到發(fā)酵液變成黑色、渾濁狀態(tài)，菌體生物量大量增加。但是，由于菌體生長(zhǎng)的不規(guī)則性，準(zhǔn)確地定量測(cè)定生物量較為困難。從圖1可以看出，糠醛可以作為A. resinae ZN1的唯一碳源及能源進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)酵，首先，糠醛快速地向糠醇轉(zhuǎn)化，隨后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為糠酸。由于糠酸可以順利進(jìn)入后續(xù)的代謝步驟，糠酸積累不顯著，并最終被完全代謝，所以在代謝進(jìn)行到42 h后，已經(jīng)看不到糠酸的積累；而糠醛還原為糠醇的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于糠醇進(jìn)一步氧化的速度，所以在糠醛快速轉(zhuǎn)化的階段(16 h至42 h之間)，糠醇的積累量要大于糠酸的積累量。對(duì)于微生物而言，糠醛對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用最大，而糠醇的毒性最弱，A. resinae ZN1將高濃度的糠醛先快速地還原為糠醇，在一定程度上就大大減弱了糠醛對(duì)其生長(zhǎng)的強(qiáng)抑制作用，然后再將弱毒性的糠醇進(jìn)一步氧化為糠酸，并將之徹底代謝掉。在有氧狀態(tài)下，A. resinae ZN1不需要特殊的營(yíng)養(yǎng)因子可以很好地降解糠醛。A. resinae ZN1可以以少數(shù)幾種無機(jī)鹽作為營(yíng)養(yǎng)代謝糠醛，表現(xiàn)出了與以往研究中脫毒菌種所不具有的獨(dú)特性質(zhì)[18,24]。

溶氧水平對(duì)真菌的液體培養(yǎng)非常重要。本研究對(duì)不同溶氧水平的A. resinae ZN1代謝糠醛的情況進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2。圖2中糠醛的轉(zhuǎn)化曲線error bar跨度比較大，分析原因可能是由于菌種接種時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)存在一定差異。本文中的保藏菌種是在PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)的，斜面上菌種的生長(zhǎng)狀態(tài)很難測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，每批種子接種時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)可能不同，因此A. resinae ZN1對(duì)糠醛的轉(zhuǎn)化速率可能會(huì)存在一定差異。

分析圖2A可知，不通空氣時(shí)，糠醛轉(zhuǎn)化和糠醇生成速率較慢，而且生成糠醇后幾乎不向糠酸轉(zhuǎn)化，也檢測(cè)不到糠酸的積累。由于糠醇對(duì)微生物的毒性很小，生物脫毒進(jìn)行到這一步，即可以進(jìn)行下一步的酶解和乙醇發(fā)酵過程。由此可見，A. resinae ZN1可以在厭氧狀態(tài)下進(jìn)行生物脫毒。圖2A還表明，在糠醛代謝完全之前葡萄糖幾乎不消耗，而在糠醛被完全代謝后，葡萄糖的消耗速度大大加快，表明當(dāng)有抑制物存在時(shí)，A. resinae ZN1優(yōu)先轉(zhuǎn)化其生長(zhǎng)抑制物。

分析圖2B可知，在較低的溶氧狀態(tài)下(0.45 vvm)，糠醛轉(zhuǎn)化和糠醇生成速率顯著增加，并出現(xiàn)有糠酸積累的階段。與厭氧狀態(tài)下糠醛代謝一致的是，糠醛首先快速轉(zhuǎn)為毒性較低的糠醇，然后再氧化成為糠酸，而氧的存在是糠醇進(jìn)一步快速氧化為糠酸的必要條件。在糠醛被完全轉(zhuǎn)化前，葡糖糖的消耗速度不大；當(dāng)糠醛被完全轉(zhuǎn)化為糠醇后，葡萄糖的消耗速度大大增加。

分析圖2C可知，在較高的溶氧水平下(1.88 vvm)，糠醛的轉(zhuǎn)化非常迅速，而由于高溶氧的存在，糠醇向糠酸的轉(zhuǎn)化也更為快速；而且糠醇和糠酸積累的階段持續(xù)時(shí)間很短。高溶氧條件下的葡萄糖利用情況與低溶氧狀態(tài)時(shí)相近。

圖2 不同溶氧水平下A. resinae ZN1對(duì)糠醛的代謝狀況Fig. 2 Influence of metabolic mechanism of furfural degradation by the kerosene fungus strain, A. resinae ZN1 at different oxygen dissolved levels. Conditions: 20% incaution, 26 °C, pH 5.5, 100 r/min.

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶氧在糠醇向糠酸轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的作用，較高的溶氧不僅可以促進(jìn)糠醇向糠酸的轉(zhuǎn)化，而且有利于糠酸在胞內(nèi)被徹底代謝為終產(chǎn)物。溶氧雖然不是A. resinae ZN1進(jìn)行糠醛降解的限制因素，但卻是糠醇進(jìn)一步向糠酸氧化的重要條件；溶氧可以顯著影響糠醛降解的速率，尤其是糠醇向糠酸氧化以及糠酸后續(xù)代謝的速率。提高溶氧水平可以大大加快A. resinae ZN1進(jìn)行糠醛脫除的速率。

為了進(jìn)一步確定溶氧在糠醛轉(zhuǎn)化過程中的作用，本研究設(shè)計(jì)了一個(gè)兩階段通氣法來研究溶氧對(duì)糠醛轉(zhuǎn)化的影響，所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，成分如下：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖20 g/L。滅菌后分別添加過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。滅菌后添加過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。兩階段通氣法是指在發(fā)酵開始前，先通入足量的氮?dú)?，以置換發(fā)酵液中的溶解氧，在發(fā)酵開始后、糠醛完全轉(zhuǎn)化的這段時(shí)間內(nèi)，不通空氣，即在糠醛完全轉(zhuǎn)化的這段時(shí)間內(nèi)是完全厭氧培養(yǎng)，之后則以0.91 vvm的通氣量通入空氣進(jìn)行有氧培養(yǎng) (圖3)。分析圖3可知，厭氧培養(yǎng)時(shí)糠醛緩慢地向糠醇轉(zhuǎn)化，在糠醛完全轉(zhuǎn)化為糠醇并開始有氧培養(yǎng)時(shí)，糠醇開始向糠酸氧化。與圖2不同的是，兩階段通氣法中糠醛是在完全厭氧的環(huán)境中還原的，此時(shí)糠醇的生成速率很慢，糠酸的積累一直很少。原因可能是由于A. resinae ZN1在長(zhǎng)時(shí)間的厭氧生長(zhǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞活力大大下降，即使重新開始通氣進(jìn)行有氧培養(yǎng)，糠醇的氧化速度依然很慢，糠酸的利用速度也很慢。結(jié)合圖2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有氧培養(yǎng)是提高細(xì)胞活力進(jìn)而提高生物脫毒速率的有效途徑。

圖3 兩階段通氣法對(duì)A. resinae ZN1代謝糠醛的影響Fig. 3 Influence of metabolic mechanism of furfural degradation by A. resinae ZN1 with the control method of the second stage. The experiment conditions: 20% incaution, 26oC, pH 5.5, 100 r/min.

2.4 A. resinae ZN1降解糠醛代謝路徑的初步解析

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文對(duì)絲狀真菌A. resinae ZN1轉(zhuǎn)化糠醛和5-羥甲基糠醛的降解代謝途徑進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖4。糠醛首先在醛還原酶作用下快速地轉(zhuǎn)化為毒性較低的糠醇；然后糠醇在醇脫氫酶作用下，再度生成不致對(duì)微生物產(chǎn)生危害的低濃度糠醛；然后，糠醛在醛脫氫酶作用下，繼續(xù)氧化為糠酸。推測(cè)糠酸的進(jìn)一步降解路徑可能與Koopman等[23]提出的Cupriavidus basilensis HMF14代謝路徑相似，通過進(jìn)入TCA循環(huán)完成糠醛的完全降解，即糠酸在糠酰輔酶A合成酶的作用下，結(jié)合一分子的HSCoA轉(zhuǎn)化為2-糠酰輔酶A (2-Furoyl-CoA)；在鉬依賴糠酰輔酶A脫氫酶的作用下，結(jié)合一分子水后轉(zhuǎn)化為5-羥基-2-糠酰-輔酶A；通過酮-醇互變異構(gòu)化，以及自發(fā)的內(nèi)酯水解或者在一般的內(nèi)酯水解酶的作用下轉(zhuǎn)化為2-氧化戊二酸和輔酶A，2-氧化戊二酸最終進(jìn)入TCA循環(huán)。

本研究推測(cè)，A. resinae ZN1的糠醛生物降解路徑與前人提出的細(xì)菌中的代謝途徑基本一致[23,25]。在本研究中，無論是厭氧狀態(tài)還是有氧發(fā)酵，均發(fā)現(xiàn)糠醛也是被A. resinae ZN1的細(xì)胞攝取并且進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，我們分析，發(fā)酵液中糠醛的減少應(yīng)該是被A. resinae ZN1的細(xì)胞一點(diǎn)一點(diǎn)地?cái)z入細(xì)胞內(nèi)，胞外的糠醛濃度才逐漸降低，然后糠醛被快速地還原為糠醇后，高濃度的糠醇又被分泌到胞外，從而能在胞外檢測(cè)到。我們認(rèn)為，A. resinae ZN1的細(xì)胞是定量分批地?cái)z入糠醛，并分泌糠醇的。因此，糠醛是被A. resinae ZN1的細(xì)胞攝取并在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化的，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別是糠醇、糠酸?？紤]到糠醛的高生物毒性，A. resinae ZN1首先是將其進(jìn)行快速地還原為較弱生物毒性的糠醇，然后再進(jìn)行氧化反應(yīng)，將高毒性抑制物的濃度維持在不影響A. resinae ZN1細(xì)胞正常生長(zhǎng)的水平，這種脫毒方式被認(rèn)為是經(jīng)典的非特異性的呋喃醛脫毒機(jī)制[22]。中間產(chǎn)物糠醇的大量積累充當(dāng)無毒性的底物泵，以供糠酸的氧化生成，糠酸是A. resinae ZN1細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)的實(shí)際底物。在本文的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，糠酸的濃度一直都不高，說明糠酸被A. resinae ZN1的細(xì)胞作為碳源以供生長(zhǎng)繁殖所需。

本文中絲狀真菌A. resinae ZN1對(duì)糠醛的降解代謝分析的結(jié)論只是初步的研究，準(zhǔn)確的代謝路徑確認(rèn)還需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和代謝組學(xué)研究支持。后續(xù)的工作包括A. resinae ZN1對(duì)木質(zhì)纖維素預(yù)處理后的有機(jī)酸類 (乙酸、甲酸、乙酰丙酸等)、苯酚類衍生物 (香蘭素、對(duì)羥基苯甲醛等) 的代謝路徑分析，以及在全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上的熒光定量PCR和生物芯片分析等，最終的目標(biāo)是將這一生物脫毒技術(shù)應(yīng)用于真實(shí)木質(zhì)纖維素加工過程，提高木質(zhì)纖維素生物煉制的過程效率、降低纖維素乙醇的成本。

圖4 A. resinae ZN1的糠醛生物降解路徑[23]Fig. 4 Biodegradation pathway of furfural by A. resinae ZN1[23].

3 結(jié)論

本研究中的絲狀真菌A. resinae ZN1在厭氧或者有氧狀態(tài)下均可以很好地降解木質(zhì)纖維素預(yù)處理后產(chǎn)生的呋喃抑制物糠醛。絲狀真菌A. resinae ZN1轉(zhuǎn)化糠醛的降解代謝途徑跟前人提出的細(xì)菌中的代謝途徑基本一致：糠醛首先快速地轉(zhuǎn)化為毒性較低的糠醇，糠醇則再度生成不致對(duì)微生物產(chǎn)生危害的低濃度糠醛，糠醛繼續(xù)氧化為糠酸。推測(cè)糠酸可能繼續(xù)進(jìn)入TCA循環(huán)，進(jìn)而完成糠醛的完全降解。結(jié)果為將來加快絲狀真菌A. resinae ZN1生物脫毒速率、改善限速步驟提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

REFERENCES

[1] Stricker AR, Mach RL, Graaff LH. Regulation oftranscription of cellulases and hemicellulasesencoding genes in Aspergillus niger and Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei). Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(2): 211?220.

[2] Larsson S, Reimann A, Nilvebrant NO, et al. Comparison of different methods for the detoxification of lignocellulose hydrolysates of spruce. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 77(1/3): 91?103.

[3] J?rgensen H, KristensenJB, FelbyC. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities. Biofuels Bioprod Bioref, 2007, 1(2): 119?134.

[4] Almeida JR, Modig T, Petersson A, et al. Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae. J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82(4): 340?349.

[5] Klinke HB, Thomsen AB, Ahring BK. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 66(1): 10?26.

[6] Jing XY, Zhang XX, Bao J. Inhibition performance of lignocellulose degradation products on industrial cellulase enzymes during cellulose hydrolysis. Appl Biochem Biotechnol, 2009, 159(3): 697?707.

[7] Palmqvist E, Hahn-H?gerdal B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I.Inhibition and detoxification. Bioresour Technol, 2000, 74(1): 17?24.

[8] Martinez A, Rodriguez ME, Wells ML, et al. Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocellulose with lime. Biotechnol Progr, 2001, 17(2): 287?293.

[9] J?nsson LJ, Palmqvist E, Nilvebrant NO, et al. Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49(6): 691?697.

[10] Yu J, Stahl H. Microbial utilization and biopolyester synthesis of bagasse hydrolysates. Bioresour Technol, 2008, 99(17): 8042?8048.

[11] Nichols NN, Dien BS, Cotta MA. Fermentation of bioenergy crops into ethanol using biological abatement for removal of inhibitors. Bioresour Technol, 2010, 101(19): 7545?7550.

[12] J?nsson LJ, Palmqvist E, Nilvebrant NO, et al. Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49(6): 691?697.

[13] Nichols NN, Dien BS, Guisado GM, et al. Bioabatement to remove inhibitors from biomass-derived sugar hydrolysis. Appl Biochem Biotechnol, 2005, 121: 379?390.

[14] Dong HW, Bao J. Biofuel via biodetoxification. Nat Chem Biol, 2010, 5(6): 317?318.

[15] Zhang J, Zhu ZN, Wang XF, et al. Biodetoxification of toxins generated from lignocellulose pretreatment using a newly isolated fungus, Amorphotheca resinae ZN1, and the consequent ethanol fermentation. Biotechnol Biofuels, 2010, 3: 26.

[16] Zhang J, Chu DQ, Yu ZC, et al. Process strategy for ethanol production from lignocellulose feedstock under extremely low water usage and high solids loading conditions. Chin J Biotech, 2010, 26(7): 950?959.張建, 楚得強(qiáng), 于占春, 等. 低水用量約束條件下的高固體含量纖維乙醇生物加工技術(shù)策略. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(7): 950?959.

[17] Converti A, Perego P, Domínguez JM. Xylitol production from hardwood hemicellulose hydrolyzates by Pachysolen tannophilus, Debaryomyces hanseniie, and Candida guilliermondii. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 82(2): 141?151.

[18] Brune G, Schoberth SM, Sahm H. Growth of a strictly anaerobic bacterium on furfural (2-furaldehyde). App1 Environ Microbio1, 1983, 46(5): 1187?1192.

[19] Taherzadeh MJ, Gustafsson L, Niklasson C, et al. Conversion of furfural in aerobic and anaerobicbatch fermentation of glucose by Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng, 1999, 87(2): 169?174.

[20] Belay N, Boopathy R, Voskuilen G. Anaerobic transformation of furfural by Methanococcus deltae (Delta) LH. App1 Environ Microbio1, 1997, 63(5): 2092?2094.

[21] Nichols NN, Sharma LN, Mowery RA, et al. Fungal metabolism of fermentation inhibitors present in corn stover dilute acid hydrolysate. Enzyme Microb Technol, 2008, 42(7): 624?630.

[22] Wierckx N, Koopman F, Luaine B, et al. Isolation and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors from lignocellulosic hydrolysate. Microbial Biotechnol, 2010, 3(3): 336?343.

[23] Koopman F, Wierckx N, Johannes HW, et al. Identification and characterization of the furfural and 5-(hydroxymethyl) furfural degradation pathways of Cupriavidus basilensis HMF14. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(11): 4919?4924.

[24] Boopathy R, Bokang H, Daniels L. Biotransformation of furfural and 5-hydroxymethyl furfural by enteric bacteria. J Ind Microbiol, 1993, 11(3): 147?150.

[25] Nichols NN, Mertens JA. Identification and transcriptional profiling of Pseudomonas putida genes involved in furoic acid metabolism. FEMS Microbiol Lett, 2008, 284(1): 52?57.

Furfural degradation by filamentous fungus Amorphotheca resinae ZN1

Xiaofeng Wang, Jian Zhang, Xiujuan Xin, and Jie Bao
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Some degradation products from lignocellulose pretreatment strongly inhibit the activities of cellulolyticenzymes and ethanol fermentation strains, thus the efficient removal of the inhibitor substances (“detoxification”) is the inevitable step for the biotransformation processes. In this study, the biological detoxification of furfural by a newly isolated fungus, Amorphotheca resinae ZN1, was studied and the metabolic pathways of furfural degradation was analyzed. The metabolic pathway of furfural degradation in A. resinae ZN1 was described as follows: first, furfural was quickly converted into the low toxic furfuryl alcohol; then the furfuryl alcohol was gradually converted into furfural again but under the low concentration under aerobic condition, which was not lethal to the growth of the fungi; furfural continued to be oxidized to furoic acid by A. resinae ZN1. It is likely that furoic acid was further degraded in the TCA cycle to complete the biological degradation of furfural. The present study provided the important experimental basis for speeding up the biodetoxification of furfural by A. resinae ZN1 and the rate-limiting step in the lignocellulose biotransformation to ethanol.

metabolic pathway, biodetoxification, furfural, lignocellulose

January 18, 2012; Accepted: June 13, 2012

Jie Bao. Tel: +86-21-64251799; E-mail: jbao@ecust.edu.cn

王曉鳳, 張建, 辛秀娟, 等. 絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛降解代謝分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(9): 1070?1079.

Wang XF, Zhang J, Xin XJ, et al. Furfural degradation by filamentous fungus Amorphotheca resinae ZN1. Chin JBiotech, 2012, 28(9): 1070?1079.

Supported by: National Basic Research Program of China (No. 2011CB707406), National Natural Science Foundation of China (No. 20976051), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2011M500742), Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No. WF0913005), Shanghai Leading Academic Discipline Project (No. B505).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB707406)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20976051)，中國(guó)博士后基金 (No. 2011M500742)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. WF0913005)，上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 (No. B505) 資助。