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        膽紅素對新生兒臍血單核細(xì)胞分泌趨化蛋白-1和白細(xì)胞介素-12的影響

        2012-02-07 00:41:12陳昌輝劉會領(lǐng)牛會琴李茂軍
        實(shí)用醫(yī)院臨床雜志 2012年5期
        關(guān)鍵詞:臍血單核細(xì)胞孵育

        陳昌輝,陳 敏,劉會領(lǐng),牛會琴,李茂軍,吳 青

        (四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒科,四川 成都 610072)

        黃疸是新生兒期常見的臨床現(xiàn)象,低水平的血清膽紅素是人體內(nèi)自由基清除劑之一,對機(jī)體具有保護(hù)作用[1]。但膽紅素水平顯著升高時,則產(chǎn)生明顯的毒性作用[2]。單核巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。本課題組前期研究表明,高濃度膽紅素可抑制單核巨噬細(xì)胞的免疫功能。本研究采用不同濃度膽紅素孵育新生兒臍血單核細(xì)胞(cord blood monocyte,CBMC),觀察CBMC單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)水平的變化,旨在進(jìn)一步探討膽紅素對單核細(xì)胞免疫功能的影響。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選擇在成都市婦產(chǎn)科醫(yī)院剖宮分娩、胎齡37~42周、出生體重2500~4000 g、Apgar評分正常的新生兒10例作為研究對象,并取得家長知情同意,其母孕期無特殊疾病史。在無菌操作條件下,用一次性采血袋采集新生兒的臍血80~150 ml,在4 h內(nèi)分離細(xì)胞。

        1.2 方法

        1.2.1 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?,RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,脂多糖(LPS)為Solarbio公司產(chǎn)品,膽紅素為Fluka公司產(chǎn)品,白蛋白和明膠為Sigma公司產(chǎn)品,F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD14單克隆抗體為Caltag公司產(chǎn)品,MCP-1和IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒由深圳晶美公司提供。

        1.2.2 CBMC的分離與鑒定 先通過密度梯度離心法分離得到臍血單個核細(xì)胞(cord blood mononuclear cell,CB-MNC),用含20%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基把CB-MNC配制成濃度為(2~5) ×106/ml的細(xì)胞懸液。再參照Freundlich[3]的方法,將細(xì)胞懸液接種于2%明膠和自體血漿包被過的塑料培養(yǎng)瓶中孵育1 h,貼壁細(xì)胞即為CBMC。洗去未貼壁細(xì)胞,加入5mM的EDTA溶液消化得到貼壁細(xì)胞。臺盼蘭檢測其活性,流式細(xì)胞儀分析其純度。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為1×107/ ml備用。

        1.2.3 膽紅素和LPS孵育臍血單核細(xì)胞 將分離得到的CBMC接種于24孔塑料培養(yǎng)板中,每例分為8個組:空白對照組(A組)、LPS對照組(B組)、6 mg/dl膽紅素對照組(C組)及5個不同濃度的膽紅素干預(yù)組[2.5 mg/dl膽紅素+LPS組(D1組)、6 mg/dl膽紅素+LPS組(D2組)、9 mg/dl膽紅素+ LPS組(D3組)、12.9 mg/dl膽紅素+LPS組(D4組)和18 mg/dl膽紅素+LPS組(D5組)]。細(xì)胞先經(jīng)不同濃度膽紅素溶液(內(nèi)含有牛血清白蛋白30 mg/L)避光孵育1 h后(反應(yīng)體系為1 ml),吸出孵育液,再加入LPS溶液(100 μg/ml),其中A組和C組加入完全培養(yǎng)基2 ml,B組和D組加入1.98 ml完全培養(yǎng)基和0.02 ml LPS溶液(反應(yīng)體系為2 ml,LPS最終濃度1 μg/ml),混勻。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后,收集上清液備用。

        1.2.4 MCP-1和IL-12水平的測定 采用雙抗體夾心的ELISA法檢測上清液中MCP-1和IL-12水平,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用PEMS 3.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。原始數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),各組方差齊,采用q'檢驗(yàn);各組方差不齊,則采用秩和檢驗(yàn)。兩變量間相關(guān)分析采用Spearman法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 單核細(xì)胞的鑒定及活性檢測 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,CD14陽性細(xì)胞率為(93.99±2.48)%; 0.4%臺盼蘭檢測細(xì)胞活性為(93.86±1.79)%,表明所得到的單核細(xì)胞純度及活性均可滿足試驗(yàn)需要。

        2.2CBMC分泌MCP-1水平的比較

        2.2.1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌MCP-1水平比較 表1顯示,LPS可促進(jìn)CBMC MCP-1的分泌。6 mg/dl濃度的膽紅素單獨(dú)即可抑制CBMC MCP-1的分泌。先經(jīng)不同濃度(2.5、6、9、12.9和18 mg/dl)膽紅素孵育,CBMC MCP-1的分泌受到不同程度的抑制,再接受LPS刺激,不能糾正膽紅素的這種抑制作用。

        2.2.2 CBMC分泌MCP-1水平與膽紅素濃度的直線相關(guān)分析 CBMC分泌MCP-1水平與膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.761,P<0.05);即隨膽紅素濃度升高,膽紅素對CBMC分泌MCP-1水平的抑制作用越明顯。

        表1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌MCP-1水平比較 [pg/ml(%)]

        2.3 CBMC分泌IL-12水平的比較

        2.3.1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌IL-12水平比較 表2顯示,LPS單獨(dú)作用可促進(jìn)CBMC IL-12的分泌。膽紅素單獨(dú)作用可抑制其分泌IL-12,當(dāng)膽紅素為6 mg/dl時,這種抑制作用已經(jīng)存在。先經(jīng)不同濃度(2.5 mg/dl、6 mg/dl、9 mg/dl、12.9 mg/dl、18 mg/dl)膽紅素孵育,CBMC IL-12的分泌受到不同程度的抑制;再接受LPS刺激,可促進(jìn)低濃度(2.5 mg/d和6 mg/dl)膽紅素孵育后的CBMC IL-12的活化恢復(fù),高濃度(12.9 mg/ dl和18 mg/dl)膽紅素孵育后的CBMC IL-12的活化仍然受抑制,當(dāng)膽紅素濃度由12.9 mg/dl上升至18 mg/dl時,IL-12的分泌受抑制程度的差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表2 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌IL-12水平比較 (pg/ml)

        2.3.2 CBMC分泌IL-12水平與膽紅素濃度的直線相關(guān)分析 CBMC分泌IL-12水平與膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.748,P<0.01)。結(jié)合D1~D5組區(qū)組的秩和檢驗(yàn)結(jié)果可知,隨膽紅素濃度升高,對CBMC分泌IL-12的抑制作用越強(qiáng)。

        2.4 CBMC分泌MCP-1和IL-12水平的相關(guān)分析 結(jié)果顯示,CBMC分泌MCP-1和IL-12水平呈正相關(guān)(r=0.653,P<0.05),即在相同濃度的膽紅素作用下,CBMC分泌MCP-1的水平隨IL-12水平的增高而增多。

        3 討論

        MCP-1是趨化因子CC亞家族中的一員,由不同類型的免疫和非免疫細(xì)胞分泌而成,對多種細(xì)胞均有趨化作用,可以引起單核巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣水平升高、呼吸暴發(fā)、粘附分子的表達(dá)、溶酶體酶及超氧陰離子的釋放并促使組織因子和促炎細(xì)胞因子的生成[4,5]。單核巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生IL-12的主要細(xì)胞,IL-12能夠促進(jìn)幼稚輔助性T淋巴細(xì)胞(Th0)向Th1細(xì)胞發(fā)展,促進(jìn)Th1細(xì)胞IL-12Rβ2鏈的表達(dá),促進(jìn)Th細(xì)胞因子特別是干擾素-γ(IFN-γ)的合成和分泌,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。IFN-γ又可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化,這樣就產(chǎn)生以細(xì)胞因子 IL-12和IFN-γ為代表的細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞之間以免疫增強(qiáng)循環(huán),在保持機(jī)體的免疫功能方面發(fā)揮重要作用[6]。膽紅素的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)是其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)。未結(jié)合膽紅素具有親脂性,分子量小,呈可超濾性,容易透過不同組織的脂性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的膜相結(jié)構(gòu),導(dǎo)致質(zhì)膜脆性增加、膜磷脂損失和膜脂成分改變,進(jìn)而引起細(xì)胞損傷[7]。

        本研究通過體外培養(yǎng)CBMC,經(jīng)膽紅素和LPS孵育處理后,采用ELISA檢測MCP-1和IL-12的水平。結(jié)果表明:LPS可促進(jìn)CBMC分泌MCP-1和IL-12。膽紅素可抑制CBMC分泌MCP-1和IL-12,隨膽紅素濃度的升高,這種抑制作用越明顯。其中低濃度(2.5 mg/d和6 mg/dl)膽紅素孵育后,再接受LPS的刺激,CBMC IL-12的分泌能力可以部分恢復(fù),MCP-1的分泌水平恢復(fù)不明顯。當(dāng)膽紅素濃度≥12.9 mg/dl時,MCP-1和IL-12的水平均不能恢復(fù)。

        膽紅素抑制CBMC分泌MCP-1和IL-12的機(jī)制可能為:①膽紅素在生物膜積聚與沉積,擾亂膜結(jié)構(gòu),通過抑制線粒體酶(如蘋果酸脫氫酶)隨后影響線粒體功能,引起能量代謝紊亂,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,從而引起分泌的減少[8,9]。②有研究表明,機(jī)體可以通過活化Toll樣受體4(TLR4)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以NF-κB依賴的途徑促進(jìn)黏附分子ICAM-1等,分泌趨化因子MCP-1,IL-8等,還可以通過活化該途徑活化單核巨噬細(xì)胞,促進(jìn)其分泌IL-12,腫瘤壞死因子-2、TNF-α等炎癥性因子和細(xì)胞因子[10]。本課題組前期研究表明,高濃度膽紅素可抑制單核細(xì)胞NF-κB活化,降低單核細(xì)胞表面分子TLRs的表達(dá),故膽紅素可能通過抑制單核細(xì)胞NF-κB活化[11],降低TLRs的表達(dá)[12],從而影響MCP-1和IL-12的分泌。③電鏡下,膽紅素孵育的單核細(xì)胞變?yōu)辄S色鋸齒狀,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹,形成空泡,引起核濃縮、核碎裂、核溶解等細(xì)胞壞死性改變[13]。推測膽紅素抑制MCP-1和IL-12分泌的機(jī)制為其破壞細(xì)胞膜及細(xì)胞核,引起細(xì)胞壞死,抑制信號傳導(dǎo)通路,最終導(dǎo)致其合成受阻,分泌減少。④膽紅素可引起細(xì)胞凋亡增多[14],最終導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌減少。

        研究提示,膽紅素進(jìn)入細(xì)胞后,可通過線粒體膜上氧化酶氧化而被清除[15],這就說明,當(dāng)細(xì)胞處于低濃度膽紅素中時,雖線粒體有一定程度抑制,但功能尚存在,仍能清除部分膽紅素。然而當(dāng)膽紅素濃度升高到一定程度(12.9 mg/dl),對細(xì)胞的毒性作用已經(jīng)很明顯,表現(xiàn)為細(xì)胞膜、核膜被破壞、細(xì)胞核碎裂[13],嚴(yán)重影響了細(xì)胞功能,導(dǎo)致線粒體功能障礙,無法清除,故由12.9 mg/dl上升至18 mg/dl時,對CBMC的活化抑制作用并沒有進(jìn)一步增強(qiáng)。

        綜上所述,膽紅素的細(xì)胞毒性顯而易見,濃度過高可顯著抑制免疫系統(tǒng),可能是高膽紅素血癥患兒易并發(fā)感染的原因之一。究竟在哪一個濃度范圍內(nèi)的膽紅素會在人體中發(fā)生毒性作用,目前尚無明確的界限。因此,臨床工作者應(yīng)在積極降低血中膽紅素水平的同時,如何阻止膽紅素?fù)p傷細(xì)胞功能,是有待進(jìn)一步深入研究的課題。

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