陳昌輝，陳 敏，劉會領(lǐng)，牛會琴，李茂軍，吳 青

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒科，四川 成都 610072)

黃疸是新生兒期常見的臨床現(xiàn)象，低水平的血清膽紅素是人體內(nèi)自由基清除劑之一，對機(jī)體具有保護(hù)作用［1］。但膽紅素水平顯著升高時，則產(chǎn)生明顯的毒性作用［2］。單核巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。本課題組前期研究表明，高濃度膽紅素可抑制單核巨噬細(xì)胞的免疫功能。本研究采用不同濃度膽紅素孵育新生兒臍血單核細(xì)胞(cord blood monocyte，CBMC)，觀察CBMC單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)水平的變化，旨在進(jìn)一步探討膽紅素對單核細(xì)胞免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在成都市婦產(chǎn)科醫(yī)院剖宮分娩、胎齡37～42周、出生體重2500～4000 g、Apgar評分正常的新生兒10例作為研究對象，并取得家長知情同意，其母孕期無特殊疾病史。在無菌操作條件下，用一次性采血袋采集新生兒的臍血80～150 ml，在4 h內(nèi)分離細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限公司，RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，脂多糖(LPS)為Solarbio公司產(chǎn)品，膽紅素為Fluka公司產(chǎn)品，白蛋白和明膠為Sigma公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD14單克隆抗體為Caltag公司產(chǎn)品，MCP-1和IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒由深圳晶美公司提供。

1.2.2 CBMC的分離與鑒定 先通過密度梯度離心法分離得到臍血單個核細(xì)胞(cord blood mononuclear cell，CB-MNC)，用含20%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基把CB-MNC配制成濃度為(2～5) ×106/ml的細(xì)胞懸液。再參照Freundlich［3］的方法，將細(xì)胞懸液接種于2%明膠和自體血漿包被過的塑料培養(yǎng)瓶中孵育1 h，貼壁細(xì)胞即為CBMC。洗去未貼壁細(xì)胞，加入5mM的EDTA溶液消化得到貼壁細(xì)胞。臺盼蘭檢測其活性，流式細(xì)胞儀分析其純度。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為1×107/ ml備用。

1.2.3 膽紅素和LPS孵育臍血單核細(xì)胞 將分離得到的CBMC接種于24孔塑料培養(yǎng)板中，每例分為8個組:空白對照組(A組)、LPS對照組(B組)、6 mg/dl膽紅素對照組(C組)及5個不同濃度的膽紅素干預(yù)組［2.5 mg/dl膽紅素+LPS組(D1組)、6 mg/dl膽紅素+LPS組(D2組)、9 mg/dl膽紅素+ LPS組(D3組)、12.9 mg/dl膽紅素+LPS組(D4組)和18 mg/dl膽紅素+LPS組(D5組)］。細(xì)胞先經(jīng)不同濃度膽紅素溶液(內(nèi)含有牛血清白蛋白30 mg/L)避光孵育1 h后(反應(yīng)體系為1 ml)，吸出孵育液，再加入LPS溶液(100 μg/ml)，其中A組和C組加入完全培養(yǎng)基2 ml，B組和D組加入1.98 ml完全培養(yǎng)基和0.02 ml LPS溶液(反應(yīng)體系為2 ml，LPS最終濃度1 μg/ml)，混勻。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，收集上清液備用。

1.2.4 MCP-1和IL-12水平的測定 采用雙抗體夾心的ELISA法檢測上清液中MCP-1和IL-12水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用PEMS 3.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。原始數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，各組方差齊，采用q'檢驗;各組方差不齊，則采用秩和檢驗。兩變量間相關(guān)分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞的鑒定及活性檢測 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，CD14陽性細(xì)胞率為(93.99±2.48)%; 0.4%臺盼蘭檢測細(xì)胞活性為(93.86±1.79)%，表明所得到的單核細(xì)胞純度及活性均可滿足試驗需要。

2.2CBMC分泌MCP-1水平的比較

2.2.1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌MCP-1水平比較 表1顯示，LPS可促進(jìn)CBMC MCP-1的分泌。6 mg/dl濃度的膽紅素單獨(dú)即可抑制CBMC MCP-1的分泌。先經(jīng)不同濃度(2.5、6、9、12.9和18 mg/dl)膽紅素孵育，CBMC MCP-1的分泌受到不同程度的抑制，再接受LPS刺激，不能糾正膽紅素的這種抑制作用。

2.2.2 CBMC分泌MCP-1水平與膽紅素濃度的直線相關(guān)分析 CBMC分泌MCP-1水平與膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.761，P＜0.05);即隨膽紅素濃度升高，膽紅素對CBMC分泌MCP-1水平的抑制作用越明顯。

表1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌MCP-1水平比較 ［pg/ml(%)］

2.3 CBMC分泌IL-12水平的比較

2.3.1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌IL-12水平比較 表2顯示，LPS單獨(dú)作用可促進(jìn)CBMC IL-12的分泌。膽紅素單獨(dú)作用可抑制其分泌IL-12，當(dāng)膽紅素為6 mg/dl時，這種抑制作用已經(jīng)存在。先經(jīng)不同濃度(2.5 mg/dl、6 mg/dl、9 mg/dl、12.9 mg/dl、18 mg/dl)膽紅素孵育，CBMC IL-12的分泌受到不同程度的抑制;再接受LPS刺激，可促進(jìn)低濃度(2.5 mg/d和6 mg/dl)膽紅素孵育后的CBMC IL-12的活化恢復(fù)，高濃度(12.9 mg/ dl和18 mg/dl)膽紅素孵育后的CBMC IL-12的活化仍然受抑制，當(dāng)膽紅素濃度由12.9 mg/dl上升至18 mg/dl時，IL-12的分泌受抑制程度的差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌IL-12水平比較 (pg/ml)

2.3.2 CBMC分泌IL-12水平與膽紅素濃度的直線相關(guān)分析 CBMC分泌IL-12水平與膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.748，P＜0.01)。結(jié)合D1～D5組區(qū)組的秩和檢驗結(jié)果可知，隨膽紅素濃度升高，對CBMC分泌IL-12的抑制作用越強(qiáng)。

2.4 CBMC分泌MCP-1和IL-12水平的相關(guān)分析 結(jié)果顯示，CBMC分泌MCP-1和IL-12水平呈正相關(guān)(r=0.653，P＜0.05)，即在相同濃度的膽紅素作用下，CBMC分泌MCP-1的水平隨IL-12水平的增高而增多。

3 討論

MCP-1是趨化因子CC亞家族中的一員，由不同類型的免疫和非免疫細(xì)胞分泌而成，對多種細(xì)胞均有趨化作用，可以引起單核巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣水平升高、呼吸暴發(fā)、粘附分子的表達(dá)、溶酶體酶及超氧陰離子的釋放并促使組織因子和促炎細(xì)胞因子的生成［4，5］。單核巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生IL-12的主要細(xì)胞，IL-12能夠促進(jìn)幼稚輔助性T淋巴細(xì)胞(Th0)向Th1細(xì)胞發(fā)展，促進(jìn)Th1細(xì)胞IL-12Rβ2鏈的表達(dá)，促進(jìn)Th細(xì)胞因子特別是干擾素-γ(IFN-γ)的合成和分泌，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。IFN-γ又可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，這樣就產(chǎn)生以細(xì)胞因子 IL-12和IFN-γ為代表的細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞之間以免疫增強(qiáng)循環(huán)，在保持機(jī)體的免疫功能方面發(fā)揮重要作用［6］。膽紅素的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)是其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)。未結(jié)合膽紅素具有親脂性，分子量小，呈可超濾性，容易透過不同組織的脂性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的膜相結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致質(zhì)膜脆性增加、膜磷脂損失和膜脂成分改變，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷［7］。

本研究通過體外培養(yǎng)CBMC，經(jīng)膽紅素和LPS孵育處理后，采用ELISA檢測MCP-1和IL-12的水平。結(jié)果表明:LPS可促進(jìn)CBMC分泌MCP-1和IL-12。膽紅素可抑制CBMC分泌MCP-1和IL-12，隨膽紅素濃度的升高，這種抑制作用越明顯。其中低濃度(2.5 mg/d和6 mg/dl)膽紅素孵育后，再接受LPS的刺激，CBMC IL-12的分泌能力可以部分恢復(fù)，MCP-1的分泌水平恢復(fù)不明顯。當(dāng)膽紅素濃度≥12.9 mg/dl時，MCP-1和IL-12的水平均不能恢復(fù)。

膽紅素抑制CBMC分泌MCP-1和IL-12的機(jī)制可能為:①膽紅素在生物膜積聚與沉積，擾亂膜結(jié)構(gòu)，通過抑制線粒體酶(如蘋果酸脫氫酶)隨后影響線粒體功能，引起能量代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而引起分泌的減少［8，9］。②有研究表明，機(jī)體可以通過活化Toll樣受體4(TLR4)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以NF-κB依賴的途徑促進(jìn)黏附分子ICAM-1等，分泌趨化因子MCP-1，IL-8等，還可以通過活化該途徑活化單核巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌IL-12，腫瘤壞死因子-2、TNF-α等炎癥性因子和細(xì)胞因子［10］。本課題組前期研究表明，高濃度膽紅素可抑制單核細(xì)胞NF-κB活化，降低單核細(xì)胞表面分子TLRs的表達(dá)，故膽紅素可能通過抑制單核細(xì)胞NF-κB活化［11］，降低TLRs的表達(dá)［12］，從而影響MCP-1和IL-12的分泌。③電鏡下，膽紅素孵育的單核細(xì)胞變?yōu)辄S色鋸齒狀，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹，形成空泡，引起核濃縮、核碎裂、核溶解等細(xì)胞壞死性改變［13］。推測膽紅素抑制MCP-1和IL-12分泌的機(jī)制為其破壞細(xì)胞膜及細(xì)胞核，引起細(xì)胞壞死，抑制信號傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致其合成受阻，分泌減少。④膽紅素可引起細(xì)胞凋亡增多［14］，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌減少。

研究提示，膽紅素進(jìn)入細(xì)胞后，可通過線粒體膜上氧化酶氧化而被清除［15］，這就說明，當(dāng)細(xì)胞處于低濃度膽紅素中時，雖線粒體有一定程度抑制，但功能尚存在，仍能清除部分膽紅素。然而當(dāng)膽紅素濃度升高到一定程度(12.9 mg/dl)，對細(xì)胞的毒性作用已經(jīng)很明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞膜、核膜被破壞、細(xì)胞核碎裂［13］，嚴(yán)重影響了細(xì)胞功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙，無法清除，故由12.9 mg/dl上升至18 mg/dl時，對CBMC的活化抑制作用并沒有進(jìn)一步增強(qiáng)。

綜上所述，膽紅素的細(xì)胞毒性顯而易見，濃度過高可顯著抑制免疫系統(tǒng)，可能是高膽紅素血癥患兒易并發(fā)感染的原因之一。究竟在哪一個濃度范圍內(nèi)的膽紅素會在人體中發(fā)生毒性作用，目前尚無明確的界限。因此，臨床工作者應(yīng)在積極降低血中膽紅素水平的同時，如何阻止膽紅素?fù)p傷細(xì)胞功能，是有待進(jìn)一步深入研究的課題。

［1］Shahab MS，Kumar P，Sharma N，et al.Evaluation of oxidant and antioxidant status in term neonates:a plausible protective role of bilirubin［J］.Mol Cell Biochem，2008，317(1-2):51-59.

［2］Vaz AR，Delgado-Esteban M，Brito MA，et al.Bilirubin selectively inhibits cytochrome coxidase activity and induces apoptosis in immature cortical neurons:assessment of the protective effects of glycoursodeoxycholic acid［J］.J Neurochem，2010，112:56-65.

［3］Freundlich B，Avdalovic N.Use of gelatin/plasma coated flasks for isolating human peripheral blood monocytes［J］.Immunol Methods，1983，62(1):31-37.

［4］Mukaida N，Harada A，Matsushima K.Interleukin-8(IL-8)and monocyte chemotactic and activating factor(MCAF/MCP-1)，chemokines essentially involved in inflammatory and immune reactions［J］.Cytokine Growth Factor Rev，1998，9(1):9-23.

［5］Meng L，Wu Z，Wang Y，et al.Differential impact of CD154 costim ulation blockade on alloreactive effector and regulatory T cells in murine renal transplant recipients［J］.Transplantation，2008，85(9):1332-1338.

［6］Elif Arioglu Oral，Edward D Javor，Li Ding，et al.Leptin replacement therapy modulates circulating lymphocyte subsets and cytokine responsiveness in severe lipodystrophy［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91:621-628.

［7］Falcao AS，Silva RF，Pancadas S，et al.Apoptosis and impairment of neurite network by short exposure of immature rat cortical neurons to unconjugated bilirubin increase with cell differentiation and are additionally enhanced by an inflammatory stimulus［J］.J Neurosci Res，2007，85(6):1229-1239.

［8］Watchko JF.Kernicterus and the molecular mechanisms of bilirubininduced CNS injury in newborns［J］.Neuromolecular Med，2006，8 (4):513-529.

［9］Oakes GH，Bend JR.Early steps in bilirubin-mediated apoptoses in murine hepatoma(Hepa 1c1c7)cells are characterized by aryl hydrocarbon receptor-independent oxidative stress and activation of the mitochondrial pathway［J］.J Biochem Mol Toxicol，2005，19(4):244-255.

［10］Ma Y，Temkin V，Liu H，et al.NF-κB protects macrophages from lipopolysaccharide-induced cell death:the role of caspase8 and receptor-interacting protein［J］.J Bio Chem，2005，280(51):41827-41834.

［11］陳敏，陳昌輝，劉會領(lǐng)，等.膽紅素對新生兒臍血單核細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2012，6(3):635-638.

［12］劉會領(lǐng)，陳昌輝，陳敏，等.膽紅素對新生兒臍血單核細(xì)胞表面分子Toll樣受體4的影響［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2011，13(2): 153-156.

［13］裴雪梅，陳昌輝，牛會琴，等.不同濃度膽紅素對新生兒臍血單核細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2009，22(5):496-499.

［14］牛會琴，陳昌輝，裴雪梅，等.膽紅素對新生兒臍血單核細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2009，16(3):1-3.

［15］Ghersi-Eqea JF，Gazzin S，Strazielle N.Blood-brain interfaces and bilirubin induced neurological diseases［J］.Curr Pharm Des，2009，15:2893-2907.