崔利園， 張釗瑞， 費(fèi)洪榮， 姚樹桐， 李曉倩， 王鳳澤△

(泰山醫(yī)學(xué)院1生物科學(xué)學(xué)院，2藥學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安271016)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是我國常見的高發(fā)性惡性腫瘤之一，其發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲是術(shù)后復(fù)發(fā)和導(dǎo)致患者死亡的主要原因［1-2］。乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein，HBXIP)由于能夠與乙肝病毒 X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的C末端結(jié)合而被命名，其在腫瘤組織中高表達(dá)，參與調(diào)控乙肝病毒的復(fù)制、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及有絲分裂等生命過程［3-5］。本實驗旨在研究HBXIP與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床上有效地治療肝細(xì)胞癌提供理論指導(dǎo)。

材料和方法

1 主要材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;穩(wěn)定高表達(dá)HBXIP的HepG2細(xì)胞系由本室保存［5］。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco;Transwell小室購自BD;明膠購自Sigma;G418購自Merck;ECL顯色試劑盒購自Pierce;β-actin抗體購自Sigma;基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)抗體購自Santa Cruz;磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，p-GSK-3β)(Thr216)抗體購自 BD;β -連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體、p-β-catenin(Thr41/Ser45)抗體和p-GSK-3β(Ser9)抗體購自Cell Signaling;兔抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1硫酸鏈霉素，37℃、5%CO2條件下孵箱培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞遷移實驗 細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后，胰酶消化并計數(shù)。將Transwell小室(8.0 μm聚碳酸酯微孔膜)放入24孔培養(yǎng)板中，上室加入適量細(xì)胞，用含0.1% 胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室培養(yǎng)基含2.5 mg/L的纖維黏連蛋白。37℃培養(yǎng)24 h后，取出微孔膜并用90% 乙醇固定15 min，棄去固定液，然后用棉球擦去膜上層細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色后計數(shù)膜下層附著的細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

2.3 明膠酶譜分析法檢測MMP-9的酶活性 無血清培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h后收集培養(yǎng)液并于4℃離心10 min(12 000 r/min)，0.22 μm濾器過濾制備成條件培養(yǎng)上清液，測定蛋白總量并進(jìn)行酶譜分析。將條件培養(yǎng)液與不含還原劑的上樣緩沖液混勻上樣于含1 g/L明膠的SDS-PAGE，然后進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將膠體置于洗脫液(含2.5%Triton X-100)中輕搖洗滌;然后放置于明膠緩沖液中37℃孵育30 h，接著加入考馬斯亮藍(lán)溶液染色2 h后，加入脫色液脫色至藍(lán)色背景上顯現(xiàn)負(fù)染條帶。凝膠中由于含有底物蛋白而染色較深，在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解底物蛋白而不被染色，進(jìn)而形成透明區(qū)域(負(fù)染)，MMP-9的酶活性與負(fù)染條帶的透明度與范圍呈正相關(guān)。

2.4 免疫印跡分析 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次后加入細(xì)胞裂解液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol·L-1EDTA，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，1 mmol·L-1PMSF，1%SDS，protease inhibitor cocktails)，冰上放置20 min后4℃13 000×g離心20 min，收集上清定量分析。取40μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE實驗，接著電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉過夜，然后分別與MMP-9抗體(1∶300)、β-catenin抗體(1∶800)、p-β -catenin(Thr41/Ser45)抗體(1∶500)、p-GSK-3β(Ser9)抗體(1∶1 000)和 p-GSK-3β(Thr 216)抗體(1∶400)室溫孵育3 h;PBST洗膜3次，每次10 min;接著分別加入相應(yīng)的兔抗小鼠IgG(1∶4 000)和山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育 1.5 h，PBST洗膜 3次，每次 10 min;最后用 ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。以β-actin作為內(nèi)參照，實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 Transwell法檢測HBXIP對HepG2肝癌細(xì)胞遷移的影響

鏡下計數(shù)Transwell小室濾膜下的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖1所示。遷移24 h后臺盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，HBXIP高表達(dá)組(HepG2-HBXIP)細(xì)胞數(shù)量明顯多于空載體對照組細(xì)胞(pCMV-tag2B)(P＜0.05)，表明 HBXIP的高水平表達(dá)可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的遷移。

Figure 1.Overexpression of HBXIP enhanced HepG2 cell migration(trypan blue staining，×100).±s.n=6.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.圖1 HBXIP對HepG2細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)作用

2 HBXIP對MMP－9活性及表達(dá)的影響

HBXIP 可明顯上調(diào)MMP-9的活性，見圖2;HBXIP同時上調(diào)HepG2細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)水平，見圖3。

3 HBXIP 對β－catenin及GSK－3β表達(dá)水平的影響

HBXIP可促進(jìn)HepG2細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，并抑制β-catenin的磷酸化，從而有利于 β-catenin的穩(wěn)定性。HBXIP抑制GSK-3β絲氨酸磷酸化，而促進(jìn)其蘇氨酸的磷酸化形式，見圖4。

Figure 2.Activity of MMP-9 in HepG2 cells induced by HBXIP.圖2 明膠酶譜法檢測HBXIP對MMP－9活性的影響

Figure 3.Overexpression of MMP-9 induced by HBXIP in HepG2 cells.±s.n=3.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.圖3 免疫印跡檢測HBXIP對MMP－9表達(dá)水平的影響

討 論

HBXIP基因由Melegari等［3］于1998年首次從 HepG2細(xì)胞中克隆獲得。作為HBx的結(jié)合蛋白，HBXIP能特異地結(jié)合HBx的C末端，通過降低HBx活性而改變乙型肝炎病毒的復(fù)制周期;HBXIP還能與生存素(survivin)形成復(fù)合物并結(jié)合pro-caspase-9，使survivin通過細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡。我們前期的研究結(jié)果顯示，HBXIP對肝癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且在肝癌組織中高表達(dá)［6］，因此推測HBXIP與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究以HepG2細(xì)胞為實驗材料，在建立穩(wěn)定高表達(dá)HBXIP蛋白細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，初步探討了HBXIP與肝細(xì)胞癌遷移的相關(guān)性及可能的分子機(jī)制。實驗結(jié)果表明，HBXIP的高水平表達(dá)促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的遷移能力，增強(qiáng)了細(xì)胞中MMP-9的活性。MMPs是以Ca2+、Zn2+等金屬離子為輔助因子的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解關(guān)系密切［7］。根據(jù)作用底物以及片段同源性，將MMPs分為:膠原酶、明膠酶(IV型膠原酶)、基質(zhì)溶酶等幾大類。明膠酶為其中重要的一類，主要有2種形式:分子量為92 kD的MMP-9和分子量為72 kD的MMP-2，兩者均與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-9］。MMP-9在腫瘤組織中以活性形式(81 kD)和非活性形式pro-MMP-9(92 kD)2種形式存在，由于在病理生理過程中起作用的主要是活化型MMPs，因此本研究主要通過明膠酶譜實驗檢測HepG2細(xì)胞中MMP-9的活性形式。

β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路的下游因子，與腫瘤的增殖、遷移侵襲及凋亡均相關(guān)，其表達(dá)水平的升高是Wnt信號通路致癌的關(guān)鍵［10］。免疫印跡結(jié)果表明，HBXIP參與調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)，HBXIP的高表達(dá)抑制了β-catenin的磷酸化，從而有利于保持細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的穩(wěn)定性，激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。GSK-3β是一種蛋白激酶，其不同的磷酸化方式(絲氨酸/蘇氨酸)對其催化活性有著不同的影響［11-13］。當(dāng)HBXIP在肝癌細(xì)胞中的高水平表達(dá)時，促進(jìn)了GSK-3β上Ser9的磷酸化而抑制了其Thr216的磷酸化。GSK-3β的Ser9磷酸化對GSK-3β的活性起抑制作用，而Thr216的磷酸化則激活GSK-3β的活性，因此HBXIP能夠通過抑制GSK-3β的激酶活性來增加β-catenin的穩(wěn)定性。

綜上所述，HBXIP具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的作用，其分子機(jī)制可能與HBXIP調(diào)節(jié)MMP-9的活性及β-catenin的穩(wěn)定表達(dá)有關(guān)。

Figure 4.HBXIP increased β -catenin level and inhibited the phosphorylation of β -catenin by regulating the phosphorylation of GSK-3β.±s.n=3.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.圖4 免疫印跡檢測 HepG2細(xì)胞中β－catenin、p－β－catenin和p－GSK－3β表達(dá)水平

［1］Mak GW，Chan MM，Leong VY，et al.Overexpression of a novel activator of PAK4，the CDK5 kinase-associated protein CDK5RAP3，promotes hepatocellular carcinoma metastasis［J］.Cancer Res，2011，71(8):2949-2958.

［2］Ren N，Wu JC，Dong QZ，et al.Association of specific genotypes in metastatic suppressor HTPAP with tumor metastasis and clinical prognosis in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2011，71(9):3278-3286.

［3］Melegari M，Scaglioni PP，Wands JR.Cloning and characterization of a novel hepatitis B virus x binding protein that inhibits viral replication ［J］.J Virol，1998，72(3):1737-1743.

［4］Marusawa H，Matsuzawa S，Welsh K，et al.HBXIP functions as a cofactor of surviving in apoptosis suppression［J］.EMBO J，2003，22(11):2729-2740.

［5］Wang FZ，F(xiàn)ei HR，Lian LH，et al.Hepatitis B x-interacting protein induces HepG2 cell proliferation through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway［J］.Exp Biol Med，2011，236(1):62-69.

［6］Wang FZ，Sha L，Zhang WY，et al.Involvement of hepatitis B X-interacting protein(HBXIP)in proliferation regulation of cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(3):431-438.

［7］李明意，姚金科，周曉華，等.MKK-4、MMP-9基因的表達(dá)與原發(fā)性肝癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2006，22(8):1480-1483.

［8］Krüger A，Kates RE，Edwards DR.Avoiding spam in the proteolytic internet:future strategies for anti-metastatic MMP inhibition［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1803(1):95-102.

［9］W?gs?ter D，Zhu C，Bj?rkegren J，et al.MMP-2 and MMP-9 are prominent matrix metalloproteinases during atherosclerosis development in the Ldlr(-/-)Apob(100/100)mouse［J］.Int J Mol Med，2011，28(2):247-253.

［10］Nejak-Bowen KN，Monga SP.Beta-catenin signaling，liver regeneration and hepatocellular cancer:sorting the good from the bad［J］.Semin Cancer Biol，2011，21(1):44-58.

［11］Liang MH，Chuang DM.Regulation and function of glycogen synthase kinase-3 isoforms in neuronal survival［J］.J Biol Chem，2007，282(6):3904-3917.

［12］Lin CL，Tseng HC，Chen WP，et al.Intracellular zinc release-activated ERK-dependent GSK-3β-p53 and Noxa-Mcl-1 signaling are both involved in cardiac ischemic-reperfusion injury［J］.Cell Death Differ，2011，18(10):1651-1663.

［13］高 明，龔 瑾，呂永添，等.β-連環(huán)素在結(jié)腸腺癌中的異常表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2010，26(5):928-930.