金德寬

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學院食品與營養(yǎng)工程學院，江蘇淮安223003）

隨著經(jīng)濟的日益發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，很多疾病的發(fā)病率迅速升高，如肥胖、高血壓、糖尿病、冠心病等，而這些疾病的發(fā)生又都與一個指標關(guān)系密切—糖代謝，正是由于體內(nèi)糖代謝紊亂，進而直接或間接引發(fā)了上述提及的各種“富貴病”，因此研究體內(nèi)的糖代謝作用顯得意義重大。靈芝酸具有抗腫瘤、抑制組胺釋放等多種藥理活性，本文利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，從三羧酸循環(huán)、電子呼吸鏈層面對于靈芝酸是否增加糖代謝作了初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑與儀器

RD Mouse cytochrome oxidade（CCO）Elisa 測定試劑盒；Labsystems Finnpipette 100 μL 單道移液器；Thermo 50 μL 8 道移液器；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；華東電子DG5033A 酶標儀：南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司；RD Mouse pyruvate carboxylase（PC）Elisa 測定試劑盒。

1.1.2 4 號樣品制備

（1）小鼠肝臟上清液制備。取10 只健康小鼠，乙醚麻醉，取肝臟放入生理鹽水中，放入勻漿機將肝臟打碎勻漿，之后用離心機離心，取得肝臟上清液。

（2）發(fā)酵液的制備。菌種：靈芝；原料：以蔗糖40 g/L，豆餅粉1.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.5 g/L；條件：起始pH6.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量100 mL，溫度30 ℃；發(fā)酵96 h。

（3）取0.5 mL 小鼠肝臟上清液+0.5 mL 發(fā)酵液+1 mL 磷酸緩沖液（Na2HPO4+NaH2PO4）+（10 mg 苯甲酸鈉+2%葡萄糖），使pH=4.5 ，在37 ℃下，水浴48 h，測定指標：糖耗量、丙酮酸、乳酸、乳酸脫氫酶、己糖激酶、細胞色素氧化酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等8 個指標。

1.2 主要測定方法

1.2.1 蛋白含量的測定（考馬斯亮蘭法）

操作步驟：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min 后，取上清液用生理鹽水1 ∶1 稀后待測。測定時，將溶液混勻，靜置10 min，按表1 所示，于595 nm 波長，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定各管OD 值。

表1 蛋白含量測定操作表Table 1 Protein determination table

計算公式：

1.2.2 乳酸（LD）測定

樣本前處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min后，取上清液用生理鹽水1 ∶1 稀后待測（部分樣本1 ∶9稀釋后待測）。測定時，將溶液混勻，按表2 所示，于530 nm，1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

表2 乳酸測定操作表Table 2 Lactic acid determination table

計算公式：

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）測定

樣本前處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min后，取上清液用生理鹽水1 ∶9 稀后待測。測定時，將溶液混勻，室溫放置3 min，按表3 所示，于440 nm，蒸餾水調(diào)零，1 cm 光徑，測各管吸光度。

表3 乳酸脫氫酶測定操作表Table 3 Lactate dehydrogenase determination table mL

定義：每克組織蛋白37 ℃與基質(zhì)作用15 min，在反應體系中產(chǎn)生1 μmol 丙酮酸為1 單位。

公式：

1.2.4 蘋果酸脫氫酶（MDH）測定

樣本前處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min后，取上清液用生理鹽水1 ∶19 稀后（部分樣本取原液）待測。

1）準備工作：按（表4）取兩只0.5 cm 光徑石英比色皿，用蒸餾水沖洗干凈，一只加入蒸餾水于340 nm處調(diào)零，另一只作測定用。

表4 蘋果酸脫氫酶測定操作表Table 4 Malate dehydrogenase determination table μL

2）在測定管中加入混合試劑1 mL，37 ℃預溫3 min，取出試管加入樣本的同時立即計時（按秒表），隨即混勻，混勻后將試管內(nèi)的反應液倒入0.5 cm 光徑石英比色皿中，于340 nm 處（蒸餾水調(diào)零）測20 s 時的吸光度OD 值（OD1），在1 分20 秒時再次測定吸光度OD 值（OD2）；

ΔA340 nm/分*＝OD1－OD2

*ΔA340 nm/分︰340 nm 處第一分鐘的吸光度差值

定義：每毫克組織蛋白在本反應系統(tǒng)中1 min 內(nèi)催化1 μmol 的底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物定義為1 個酶活力單位。

計算公式：

*6.2：底物的微摩爾消光系數(shù)

**0.5：比色皿的比色光徑

測定管ΔA340 nm/分：20 s 時測定管的吸光度OD減去1 分20 秒時的測定管吸光度OD；

空白管ΔA340nm/分：20 s 時空白管的吸光度OD減去1 分20 秒時的空白管吸光度OD。

1.2.5 丙酮酸含量測定

樣本前處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min后，取上清待測。測定時，取出上清液室溫放置5 min，按表5 所示，于505 nm 處，1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度OD 值。

計算公式：

表5 丙酮酸含量測定操作表Table 5 Pyruvic acid determination table

1.2.6 細胞色素氧化酶測定（CCO）

操作步驟：1）樣本前處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min 后，取上清液10 μL 待測。

2）測定過程：嚴格按照試劑盒的說明進行操作。

計算：根據(jù)制備的標準曲線，計算樣本含量，見表6。

表6 標準曲線準備Table 6 Preparation of standard curve

1.2.7 丙酮酸羧化酶（PC）測定

操作步驟：1）樣本前處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min 后，取上清10 μL 測。

2）測定過程：嚴格按照試劑盒的說明進行（表7）操作。

表7 丙酮酸羧化酶測定操作表Table 7 Pyruvate carboxylase determination table

1.2.8 己糖激酶的測定

樣本預處理：組織勻漿2 500 r/min，離心10 min后，取0.05 mL 上清液待測。

加樣本的同時開始計時，充分混勻后，倒入0.5 cm光徑的石英比色皿中，波長340 nm，記錄30 s 時初始吸光度A1值，然后將比色皿中的反應液倒入預先編號的試管中，放入37 ℃水浴箱中準確水浴20 min，然后取出試管測定20 分30 秒時的吸光度A2值。

計算公式：

蛋白質(zhì)濃度（g/Prot/L）

定義：在37 ℃，pH7.6 的條件下，每克組織蛋白在本反應體系中每分鐘生成1 mmol/L 的NADPH 定義為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝酸對糖耗量速率的影響

研究結(jié)果如圖1。

圖1 顯示無論是來源于菌絲體提還是發(fā)酵液的靈芝酸或者用大孔樹脂獲得的靈芝酸提取物均有提高小鼠肝臟的糖耗量的作用，其中尤以發(fā)酵液的提高最為明顯，從對照的0.097 g/（Lh）提高到0.133 g/（Lh），因此進一步分析靈芝酸對糖代謝酶活性的影響是必要的。

2.2 靈芝酸對己糖激酶的影響

己糖激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，也是糖進入細胞內(nèi)參與糖代謝反應的第一個酶，它催化葡萄糖磷酸化成為6－磷酸葡萄糖，它是整個糖代謝的限速酶，因此分析了靈芝酸對己糖激酶的影響。結(jié)果如圖2 顯示無論來源于對菌體的還是發(fā)酵液的靈芝酸均能增強己糖激酶，尤其以發(fā)酵液己糖激酶活性增加最為明顯，其次為大孔樹脂提取的靈芝酸。

2.3 靈芝酸對丙酮酸羧化酶的影響

丙酮酸羧化酶在體內(nèi)催化丙酮酸生成草酰乙酸，是一個調(diào)節(jié)酶，它是一種別構(gòu)酶，平時活性很低，是三羧酸循環(huán)的回補反應，草酰乙酸既是糖異生的中間物，也是三羧酸循環(huán)的中間物，因此草酰乙酸聯(lián)系著糖異生作用和三羧酸循環(huán)，因此在體內(nèi)作用也是非常顯著，該酶活性缺乏，無論糖異生還是三羧酸循環(huán)都不能正常進行，易導致代謝紊亂。實驗結(jié)果如圖3 顯示，靈芝酸增強了該酶的活性，尤其是發(fā)酵液中的靈芝酸最為顯著。

2.4 蘋果酸脫氫酶

蘋果酸脫氫酶在體內(nèi)催化草酰乙酸形成蘋果酸，只有形成蘋果酸細胞質(zhì)中的蘋果酸才能穿過線粒體膜進入線粒體，或者線粒體內(nèi)的蘋果酸才能進入細胞質(zhì)中，因此對于補充三羧酸循環(huán)同樣是很重要的。試驗結(jié)果如圖4 顯示發(fā)酵液的靈芝酸增加酶活性最為顯著，其次是大孔樹脂提取物。

2.5 細胞色素氧化酶（CCO）

細胞色素氧化酶是體內(nèi)細胞色素aa3的復合物，含鐵，這種酶的作用是把細胞色素a 的電子傳遞給氧分子，激活分子氧與質(zhì)子結(jié)合為水，也是呼吸鏈的關(guān)鍵酶。該酶活性的增強說明體內(nèi)生物氧化活性增強。實驗結(jié)果如圖5 顯示發(fā)酵液的靈芝酸作用效果最為顯著，其次為大孔樹脂提取物。

2.6 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶是一種糖酵解支路的酶。乳酸脫氫酶存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，幾乎存在于所有組織中。乳酸脫氫酶不是糖酵解的限速酶，它能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的酶，是糖代謝支路的一個酶，可以指示糖的代謝路徑。試驗結(jié)果如圖6 顯示，添加靈芝酸（發(fā)酵液或菌絲體），酶活性都顯著減少，尤其是發(fā)酵液減少最多。

2.7 丙酮酸含量

丙酮酸是參于整個生物體基本代謝的中間產(chǎn)物之一?？赏ㄟ^乙酰CoA 和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化，因此，丙酮酸在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。丙酮酸位于無氧分解和有氧分解的交界點上，是極為重要的中間產(chǎn)物。此外，從丙酮酸可直接生成丙氨酸，因為它可以與氨基轉(zhuǎn)移反應相結(jié)合，故在氮代謝方面也起著重要的作用。另外，它和CoA 反應能形成乙酰CoA，與脂肪酸的代謝也有重要的關(guān)系。因此測定丙酮酸含量對于研究糖耗量的代謝途徑具有重要的意義。實驗結(jié)果如圖7 顯示無論來自發(fā)酵液還是菌絲體的靈芝酸均能增加糖耗量，尤其是發(fā)酵液增加最為顯著，其次為大孔樹脂提取物。

2.8 乳酸含量

新陳代謝和運動中乳酸不斷產(chǎn)生，但是其濃度一般不會上升。只有在乳酸產(chǎn)生過程加快，乳酸無法被及時運走時其濃度才會提高。乳酸運輸速度由一系列因素影響，其中包括單羧基轉(zhuǎn)運體、乳酸脫氫酶的濃度和異構(gòu)體形式、組織的氧化能力。一般來說當組織的能量無法通過有氧呼吸得以滿足，組織無法獲得足夠的氧或者無法足夠快地處理氧的情況下乳酸的濃度會上升。在這種情況下丙酮酸脫氫酶無法及時將丙酮酸轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A，丙酮酸開始堆積。升高的丙酮酸誘導乳酸脫氫酶形成乳酸，使得糖酵解順利進行。試驗結(jié)果如圖8 顯示無論發(fā)酵液還是菌體的靈芝酸均能降低乳酸含量，但是降低的幅度很小。

2.9 靈芝酸提高糖耗量的機理分析

上述結(jié)果顯示，無論來源于發(fā)酵液還是菌體的靈芝酸都顯著增加了糖耗量，增加糖耗量的方式有多種，在我們的反應系統(tǒng)中增加糖耗量主要包括厭氧代謝和好氧代謝兩條途徑。試驗結(jié)果己糖激酶活性的增加，說明靈芝酸增加了糖的代謝，促進糖酵解途徑。乳酸脫氫酶活性和乳酸含量均有不同程度的降低，說明靈芝酸增加糖耗量不可能通過厭氧代謝增加。丙酮酸含量的增加，說明靈芝酸增加糖耗量可能還有其它途徑。進一步分析丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶活性顯示這兩個酶活性顯著增強，說明靈芝酸增加糖代謝可能是通過丙酮酸羧化酶作用生成草酰乙酸，然后經(jīng)蘋果酸脫氫酶作用生成蘋果酸，參與三羧酸循環(huán)，而在人體內(nèi)蘋果酸可以穿過線粒體膜進入線粒體參與三羧酸循環(huán)，細胞色素氧化酶活性顯著增強說明，靈芝酸增強了體內(nèi)的生物氧化?？傊`芝酸通過增加三羧酸循環(huán)的補給途徑增加了糖的有氧氧化，增加了糖耗量。

至于發(fā)酵液和菌絲體中靈芝酸作用效果的差異，可能有兩種原因：菌絲體提取液和發(fā)酵液中靈芝酸含量不同，或者它們主要組分結(jié)構(gòu)不同。

3 小結(jié)

分析了靈芝酸對試驗小鼠肝臟糖耗量的影響：結(jié)果為發(fā)酵液、菌絲體以及從發(fā)酵液中提取的的靈芝酸均能提高糖耗量，分析了糖代謝酶活性和中間代謝產(chǎn)物的變化，己糖激酶活性顯著增加，乳酸脫氫酶和乳酸含量均有不同程度降低，丙酮酸含量增加，丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶活性顯著增強，細胞色素氧化酶活性顯著增強，我們推斷出靈芝酸主要通過增加糖的好氧代謝提高糖耗量。該實驗結(jié)果從分子水平闡述了靈芝酸調(diào)節(jié)人體糖代謝的作用機制，為靈芝酸廣泛的藥理活性提供了新的理論基礎(chǔ)。

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