王文春 李 江 楊 陽(yáng)

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

黑骨藤為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株。主產(chǎn)于西南的貴州等地，該屬植物全世界共12種，我國(guó)產(chǎn)4種，均為藥用植物，主要分布在西南地區(qū)［1－3］。黑骨藤被貴州省藥材標(biāo)準(zhǔn)收載的一種苗藥，為貴州十大苗藥之一，其全株入藥，具有通經(jīng)、活血、解毒、祛風(fēng)的功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、胃痛、消化不良、閉經(jīng)、痢疾等［3－6］，是民間廣泛應(yīng)用于治療閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕與類風(fēng)濕等疾病的民族藥［2－4］;有研究［7］表明苗藥黑骨藤藥效與黃酮含量在一定的范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，黃酮含量越高，抗炎作用越明顯。隨著對(duì)黑骨藤研究的不斷深入，特別是在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕痹痛、腰椎骨質(zhì)增生等方面的廣泛應(yīng)用，使其需求量逐年增大。為了評(píng)價(jià)黑骨藤質(zhì)量的優(yōu)劣，我們以槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷為指標(biāo)，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量，從而為全面評(píng)價(jià)黑骨藤藥材質(zhì)量提供參考依據(jù)，為合理開(kāi)發(fā)利用黑骨藤藥材資源提供基本資料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津LC－20AT高效液相色譜儀DAD紫外檢測(cè)器、威瑪龍色譜工作站、AE/240型電子天平(上海梅勒儀器有限公司)、AVY220型電子天平(日本島津)、SK8210HP型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)儀器有限公司)。

1.2 試藥：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對(duì)照品(天津馬克生物技術(shù)有限公司)，黑骨藤藥材分別采至貴州貴陽(yáng)(烏當(dāng)下壩、香紙溝)、興義、安順、凱里等地，并經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院孫慶文老師鑒定為正品，陰干。甲醇(分析純，95%)，甲醇(色譜純，批號(hào)111663)，水(娃哈哈純凈水，批號(hào)121700)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：Hypersil－C18色譜柱(4.6mm ×250mm，5μm) ，甲醇：水(33：67)為流動(dòng)相，流速為 1mL/min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)370nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。在上述色譜條件下槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷與其他組分分離度良好。

2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對(duì)照品10.16mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻;精密吸取該對(duì)照品液1mL至10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.02mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備：將藥材粉碎，取本品中粉2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，稱定，加熱回流提取2h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm的微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察：精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對(duì)照品1.27mg置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷0.127mg的對(duì)照品液。精密吸取該對(duì)照品溶液 2，4，6，8，10，12μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表1。以對(duì)照品的進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程，看其線性關(guān)系是否良好。

經(jīng)計(jì)算的槲皮素－3－o－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的回歸方程為：Y=1.0E+6X －21142，r=0.9999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷在0.254～1.524μg有良好的線性關(guān)系。

圖2 黑骨藤樣品及對(duì)照品HPLC A.對(duì)照品 B.樣品

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取上述槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對(duì)照品液10μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD為2.97%，說(shuō)明該方法及儀器具有良好的精密度。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批號(hào)樣品 ，按供試品溶液的制備方法操作，分別于0，2，4，8，12，24 h精密吸取10μL進(jìn)樣，測(cè)得槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD為1.56%，說(shuō)明樣品至少在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)樣品6份，分別制備供試液，測(cè)得槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD為0.07%，說(shuō)明測(cè)量方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)：采用加樣回收法，取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，其結(jié)果見(jiàn)表5。

加樣回收率=(測(cè)得量—原有量)/加入量×100%

表5 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：RSD為1.51%，說(shuō)明所建立的方法加樣回收率較高，符合含量測(cè)定要求。

2.4.6 樣品中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量測(cè)定：取5批藥材樣品，按照上述含量測(cè)定方法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果，其結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 含量測(cè)定結(jié)果(n=5)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所采的5批黑骨藤藥材中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的平均含量為0.2288mgμg－1，其中貴陽(yáng)香紙溝黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷含量最高，含量為0.2410mgμg－1;興義黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷含量最低，含量為 0.2195mgμg－1。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動(dòng)相的選擇：黑骨藤中含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、生物堿類、內(nèi)酯類、三萜類等多種活性成分，成分較為復(fù)雜［8］，為色譜條件的篩選增加不少難度。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)研究中考查了甲醇－水、乙腈－水不同比例的流動(dòng)相，以甲醇－水(33：67)作為流動(dòng)相得到比較為滿意的結(jié)果。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)及用二極管陣列檢測(cè)器從190～400nm進(jìn)行光譜掃描，槲皮素3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對(duì)照品在370 nm處有最大吸收，故選擇370 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方法和條件的選擇

3.2.1 提取方法的選擇：方法學(xué)考察過(guò)程中，對(duì)超聲處理、加熱回流及冷浸的提取方法進(jìn)行了比較試驗(yàn)，結(jié)果表明加熱回流提取法效果優(yōu)于其他兩種方法，故選用加熱回流法制備本實(shí)驗(yàn)用樣品溶液。

3.2.2 提取溶劑的選擇：根據(jù)槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的溶解性選用甲醇、乙醇作為提取溶媒，進(jìn)行選擇，并對(duì)30%甲醇、50%甲醇、純甲醇、無(wú)水乙醇、50% 乙醇進(jìn)行了比較試驗(yàn)，結(jié)果表明提取溶媒為純甲醇時(shí)干擾較少，效果優(yōu)于其他溶劑提取，故選用提取溶媒為甲醇。

3.2.3 提取時(shí)間的選擇：確定選用回流提取法，甲醇為提取溶媒后，分別又對(duì)回流1，1.5，2，2.5，3 h進(jìn)行了比較試驗(yàn)，結(jié)果表明回流提取2 h即能較完全提取出黑骨藤中的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷，故選用回流提取2 h為樣品提取時(shí)間。

3.3 結(jié)論：采用本試驗(yàn)所建立的方法測(cè)定了5批不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量，結(jié)果平均含量為0.2288mgμg－1，最低為興義產(chǎn)只有0.2195mgμg－1，最高為貴州貴陽(yáng)市郊香紙溝產(chǎn)含量為0.2410mgμg－1，不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中槲皮素 －3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量有明顯差異;一般黑骨藤喜生于陰濕的灌木叢中，我們意外發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在水分較少的石巖縫隙中的黑骨藤雖長(zhǎng)勢(shì)欠佳，但內(nèi)部質(zhì)量較佳;為此，認(rèn)為還需進(jìn)一步探索。說(shuō)明苗藥黑骨藤質(zhì)量受產(chǎn)地、環(huán)境、氣候、光照等的影響。

［1］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M］.2003年版.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：381.

［2］包駿，冉懋雄.貴州苗族醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)［M］.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，1999：188.

［3］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(苗藥卷)［M］.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2005：526.

［4］貴州植物志編輯委員會(huì).貴州植物志(第四卷)［M］.成都：四川民族出版社，1989：493－509.

［5］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

［6］貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［S］.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003.

［7］張 宏，景小楠，于樹(shù)華，等.黑骨藤中總黃酮含量的測(cè)定［J］.四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，33(1)：93.

［8］王富花，郁建平.藥用植物黑骨藤化學(xué)成分研究初報(bào)［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2008，27(6)：560.