魯 藝， 程發(fā)峰， 暢洪升， 鐘相根， 王慶國

(1.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院， 北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院， 北京 100102)

體內(nèi)過多的活性氧(ROS)引起的氧化應激(Oxidative stress)是涉及人類多種疾病的發(fā)展與生理功能改變的一個重要因素。ROS是一類化學性質(zhì)非常活潑的含氧原子或原子團，主要包括超氧陰離子自由基(02-)、羥自由基(-OH)和過氧化氫(H2O2)等。自由基增多對機體的毒害作用是多方面的，其中最容易受到攻擊的是細胞膜及脂蛋白中的多聚不飽和脂肪酸，導致所謂的脂質(zhì)過氧化。自由基可以通過氧化、交聯(lián)、肽鏈斷裂或聚集等方式使蛋白質(zhì)、脂蛋白、酶蛋白、受體蛋白變性，引起酶失活和腦細胞結(jié)構(gòu)功能損傷、壞死；也可以破壞RNA、DNA，引起基因突變，使轉(zhuǎn)錄異常、DNA復制異常，使機體發(fā)生免疫反應及癌變，細胞也可能因此而死亡。腦組織由于耗氧量較高而抗氧化酶活性較低，容易遭受自由基等氧化劑的損傷。因此，應用抗氧化劑清除大腦中起到破壞作用的自由基，對于預防和治療中風以及神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。

清開靈在清熱解毒通絡機理方面已進行了深入研究，但其體外抗氧化能力及其相關(guān)機制尚缺乏足夠的證據(jù)。因此，本實驗從抗氧化反應的不同環(huán)節(jié)和靶點為切入點，在化學反應體系及基于細胞活性的生物體外反應體系中，分別觀察了清開靈對自由基的清除能力、對黃嘌呤氧化酶的抑制作用以及對氧化損傷細胞的保護作用，并與已知的天然抗氧化劑槲皮素進行比較來研究清開靈的體外抗氧化機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 Xanthine，xanthine oxidase(XO)，hypoxanthine，XTT，MTT 購自Sigma，Taufkirchen，Germany。清開靈注射液由北京中醫(yī)藥大學藥廠提供，槲皮素(quercetin)由FU實驗室提供。SK-N-SH人神經(jīng)母細胞瘤細胞株，購自 American Type Culture Collection(ATCC，No.HTB-11)。細胞培養(yǎng)液DMEM(sigma公司，D5796)，500 mL DMEM中加入5mL Na3PO4(sigma公司，10101-89-0)，5 mL非必需氨基酸溶液(GIBCO公司，1127865)及50 mL胎牛血清(Hyclone公司，SH30070)，胰蛋白酶(美國sigma公司，T4799)。

1.2 方法

1.2.1 XO/XTT體系中自由基清除能力檢測 模擬人體黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)，產(chǎn)生O2-。參照Ukeda 等[1]方法操作，簡述如下：50 mM Na2CO3buffer 調(diào)整PH值為10，取25 mL，與3 mM xanthine，3 mM EDTA，1.6 Mmxtt溶液各1 mL混合，充分混合溶解后，將溶液轉(zhuǎn)入96孔酶標盤中，每孔230 μL。清開靈稀釋為濃度分別為100、10、1 mg/mL，對照組加入等量的0.2% DMSO溶液。槲皮素作為陽性對照物。起始反應前每孔加入10 mL xanthine oxidase(0.056 unit)，反應1 h。1 h后測定470 nm處吸光度。以對照孔的吸光度值代表對照組O2-的量為100%，其余各組超氧陰離子以百分數(shù)表示，(各組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.2.2 黃嘌呤氧化酶致尿酸生成檢測 試管中分別加入40 mM Na2CO32.5、0.1 mM EDTA，0.04 mL，mM xanthine 0.04 mL and 0.04 mL 清開靈與槲皮素溶液并充分混合。反應開始前加入0.01 mL xanthine oxidase(0.04 Units)在293 nm分光光度儀檢測吸光度。

1.2.3 SK-N-SH細胞的培養(yǎng) SK-N-SH細胞在含10%胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)基中，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，3 d換1次液，5 d傳一代。傳代時，先倒掉舊培養(yǎng)基，適量PBS液洗滌細胞1次以除去殘留培養(yǎng)基，倒掉PBS液，加入0.25%胰蛋白酶液1～2 mL，消化1 min后，輕輕拍打細胞培養(yǎng)瓶，鏡下觀察細胞，待細胞變圓并分散游動后，倒掉胰蛋白酶液，加入新鮮的含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基2 mL，用吸管吹打使細胞均勻分散為單層細胞，按1∶2分裝入新的細胞培養(yǎng)瓶中。

1.2.4 次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘導的細胞氧化損傷及藥物保護作用 SK-N-SH 細胞接種在96孔板中，每孔細胞數(shù)為1×104cells/well。24 h后將培養(yǎng)液移走，100 μM，50 μM，10 μM hypoxanthine 和2 mU/mL xanthine oxidase 溶解在 PBS中，每孔加入100 μL。分別孵育0.5、1、1.5 h。孵育相應的時間后，用MTT法檢測各個濃度及作用時間的細胞存活率。

SK-N-SH 細胞接種在96孔板中，每孔細胞數(shù)為1×104cells/well。24 h后將培養(yǎng)液移走，100 μM hypoxanthine 和2 mU/mL xanthine oxidase 溶解在 PBS中，每孔加入100 μL。清開靈與槲皮素溶解在0.2%DMSO溶液中，終濃度為100、10、1 μg/mL也加入到細胞孔中，每孔100 μL。孵育 0.5、0.5 h 后，上清液吸走，換成含胎牛血清10%的MEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、24 h后，新鮮配制MTT溶液，將MTT鹽溶解在PBS溶液中，使其濃度為5 mg/mL。每孔加入MTT溶液20 μL，搖床上輕輕震蕩3 min，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清，每孔加入100 lDMSO，搖床輕度震蕩15 min，待紫色沉淀充分溶解后，測OD值，檢測波長為580 nm，參考波長為620 nm。以對照組細胞存活率為100%，其余各組按存活率(%)=(各組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

2 實驗結(jié)果

2.1 清開靈的自由基清除能力 在濃度為100 μg/mL時，清開靈的自由基清除率高達56.43±3.98%(P<0.01)，略高于槲皮素；在濃度為10 μg/mL時，清開靈的自由基清除率28.07±2.52%(P<0.05)與同濃度槲皮素相當；在濃度為1 μg/mL時，二者自由基清除率均未與對照組顯示顯著差異。見表1。

2.2 清開靈對黃嘌呤氧化酶的抑制作用 清開靈在3個濃度均顯示顯著的抑制黃嘌呤氧化酶的作用，其在濃度100、10、1 μg/mL時，對黃嘌呤氧化酶的抑制率分別為72.59±4，76，66.1±2.98，57.94±3.81%，說明其對黃嘌呤氧化酶具有明顯的抑制作用。見表1。

表1 自由基清除能力和黃嘌呤氧化酶活性 ±s ，%，n=8)

2.3 清開靈對次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘導的細胞氧化損傷的保護作用 在生理條件下，次黃嘌呤(hypoxanthine，HPX)在黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)的催化下可以生成黃嘌呤，并進一步氧化生成尿酸，同時產(chǎn)生超氧陰離子自由基，大量超氧陰離子堆積可以產(chǎn)生毒性，從而引起細胞和組織損傷。本實驗在SK-N-SH細胞模型上，應用hypoxanthine 和xanthine oxidase反應體系(HPX/XO)建立細胞氧化損傷模型，通過MTT比色法分析細胞存活率的變化，從而揭示清開靈對細胞氧化損傷的保護作用。SK-N-SH細胞在hypoxanthine 100 μM，xanthine oxidase 2 mU/mL濃度下，作用0.5 h的條件下，細胞存活率明顯下降，為正常組的58%。見表2。所以在該濃度及作用時間下，細胞氧化損傷的模型建立成功。在此模型上，加入藥物之后可以看到，清開靈在100、10、1 μg/mL濃度下，可使細胞在HPX/XO氧化反應損傷條件下的存活率較模型組分別有顯著提高，見表3。

表2 不同時間點，不同濃度的HPX 在SK-N-SH細胞上對細胞生存率比較

表3 清開靈注射液對SK-N-SH細胞生存率比較或%，n=8)

4 討論

氧化應激是指機體或細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導致活性氧在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。活性氧包括H2O2、O2·-、OH·，NO·等[2]。在病理因素作用下，氧化應激造成細胞損傷包括：(1)氧化DNA，攻擊核物質(zhì)，使染色質(zhì)濃縮，DNA斷裂，引起核苷酸二聚體化，復制過程出現(xiàn)錯誤，基因表達和調(diào)控異常[3]；(2)氧化細胞內(nèi)很多重要的蛋白質(zhì)，改變其成分和活性，如酶、結(jié)構(gòu)蛋白等，使其功能改變[4]；(3)氧化細胞及亞細胞成分脂膜，引起生物膜不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應，造成膜完整性及通透性破壞，最終導致膜功能障礙以及細胞溶解死亡[5]。上世紀70年代以來，生物學和醫(yī)學的研究與實踐積累了大量資料，證明氧化應激可導致人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展，加速人體的衰老。近年來的研究顯示，氧化應激是導致多種神經(jīng)退行性疾病主要的病理因素之一，其中包括慢性神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD)，和急性腦神經(jīng)性疾病如中風[6]。

清開靈注射液被廣泛用于治療腦病，尤其是急性中風。目前，有文章已經(jīng)研究證實清開靈對卒中動物模型具有良好的抗氧化作用，可以下調(diào)腦組織中MDA含量和SOD活性，并可減少ROS含量[7]。但是目前研究較多的集中在中藥對氧化終產(chǎn)物含量的干預作用上，而對生理條件下超氧自由基離子生成過程及環(huán)節(jié)的干預作用研究甚少。槲皮素是一種良好的抗氧化成分[8]，體外抗氧化作用主要包括直接清除超氧陰離子、羥自由基、脂質(zhì)過氧化自由基等活性氧自由基，及可以抑制黃嘌呤氧化酶活性[9～10]。本實驗結(jié)果表明，清開靈對氧自由基有很強的清除作用，其清除能力與天然槲皮素相當；在抑制黃嘌呤氧化酶作用方面，清開靈的作用優(yōu)于槲皮素?？梢?，清開靈的抗氧化作用，不僅體現(xiàn)在清除自由基，也體現(xiàn)在干預氧化反應的酶活性方面，揭示了清開靈可從多個環(huán)節(jié)和途徑阻止氧化反應的發(fā)生和發(fā)展。HPX/XO誘導的細胞氧化損傷模型進一步證實了清開靈的抗氧化作用。經(jīng)過HPX/XO反應體系處理后的SK-N-SH細胞，細胞存活率明顯下降，清開靈可顯著提高細胞生存率，進一步顯示出清開靈良好的體外抗氧化活性。筆者也證實了清開靈在缺血性中風及某些神經(jīng)退行性病變中有一定的治療作用[11～12]，而其從多個環(huán)節(jié)和途徑的抗氧化活性可能是其主要藥效機制之一。

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