譚波濤，郝媛媛，丁軼聰

（阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽阜陽 236112）

高效液相色譜法測定肉制品中甘草抗氧化物的含量*

譚波濤，郝媛媛，丁軼聰

（阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽阜陽 236112）

建立了測定肉制品中甘草抗氧化物含量的方法。樣品經(jīng)流動(dòng)相提取，采用C18色譜柱分離，以甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰乙酸（體積比70∶29∶1）為流動(dòng)相，流速為1.0m L/m in，波長為250nm，以保留時(shí)間進(jìn)行定性，峰面積進(jìn)行定量。甘草酸在 1.0～80.0μg/m L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為 y=8.55×10－5x-0.599（r=0.999 7），檢出限為 1.0mg/kg，定量限為 3.0mg/kg，加標(biāo)回收率為 95.7%～103.4%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.57%～3.53%（n=6）。該方法適用于檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)日常檢驗(yàn)中大批量肉制品中甘草抗氧化物含量的測定。

高效液相色譜；肉制品；甘草抗氧化物

甘草抗氧化物（Antioxidant of glycyrrhiza,CNS號(hào) 04.008）是一種抗氧化劑，以甘草中提取出的甘草浸膏或甘草酸后的殘?jiān)鼮樵?，用乙醇或其它有機(jī)溶劑提取后經(jīng)脫溶濃縮、干燥而得的產(chǎn)品[1,2]，其含量通常以甘草酸計(jì)。甘草酸分子式為C42H62O16,摩爾質(zhì)量為822.93 g/mol?！妒称诽砑觿┦褂眯l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[3]中規(guī)定，在基本不含水的脂肪和油、方便米面制品、餅干、腌臘肉制品、醬鹵肉制品、熏燒烤肉類、油炸肉類、西式火腿、肉灌腸類、發(fā)酵肉制品、腌制水產(chǎn)品、油炸食品等中允許限量使用，最大使用量均為0.2 g/kg，在其它食品中不允許使用。臨床醫(yī)學(xué)研究證明，長期濫用甘草酸會(huì)產(chǎn)生全身浮腫、血鈉濃度增高等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致高血壓等疾病。

肉制品中甘草抗氧化物的測定，目前國內(nèi)缺少相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法，文獻(xiàn)報(bào)道的多為高效液相色譜法、薄層掃描法等測定中藥材中的甘草酸含量[4-8]。筆者建立一種高效液相色譜法測定肉制品中甘草抗氧化物的方法，該方法精密度、準(zhǔn)確度高，檢出限低，實(shí)用性強(qiáng)，適用于檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)日常檢驗(yàn)需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Aglient 1260型，配二級(jí)管陣列檢測器、多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，美國Aglient公司；

去離子水發(fā)生器：AXLB 1020-1型，美國阿修羅科技發(fā)展有限公司；

高速旋轉(zhuǎn)離心機(jī)：TDZ 4-WS型，西安東瑞科教實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

電子天平：BSA 224S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

超聲波儀：SK 1200H型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

甲醇：色譜純；

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度不低于99%，上海安譜科技有限公司；

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸銨、冰乙酸：分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Aglient C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.2 mol/L 乙酸銨 -冰乙酸(體積比 70∶29∶1)；流速：1.0m L/m in；進(jìn)樣量：10μL ；柱溫：30℃。

碳交易促進(jìn)企業(yè)改善技術(shù)水平，提高長期經(jīng)濟(jì)效益。碳交易市場是政府根據(jù)外部性原理強(qiáng)行創(chuàng)造出來的一個(gè)新市場，所以碳交易市場在誕生和成長過程中，影響最大的都是政策性因素；當(dāng)?shù)貐^(qū)生產(chǎn)總值較高時(shí)，碳排放數(shù)量也較高，但是碳排放數(shù)量高不一定導(dǎo)致碳交易金額高，一般來說，碳配額不足的企業(yè)會(huì)購買配額，碳配額多余的企業(yè)會(huì)出售配額，但是企業(yè)的碳配額充足與否與企業(yè)的碳排放數(shù)量無關(guān)，主要與企業(yè)自身的技術(shù)水平和碳交易政策等因素相關(guān)；企業(yè)無法改變國家的碳交易政策，所以企業(yè)會(huì)不斷改善技術(shù)水平，以降低碳排放成本，同時(shí)提高企業(yè)的長期經(jīng)濟(jì)效益。

1.3 樣品前處理

稱取樣品 2.0～3.0g（精確至 0.1 mg）于 25 m L比色管中，用流動(dòng)相適當(dāng)溶解并稀釋樣品，然后加入乙酸鋅溶液（220g/L）和亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）各2 m L，稍震蕩后用流動(dòng)相定容至25 m L,超聲30min，以3 000r/m in高速離心10m in，取上清液待測。

1.4 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，以流動(dòng)相溶解定容，配制成1.0mg/m L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.5 測定方法

取10μL樣品溶液和甘草酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,分別注入高效液相色譜儀中,按1.2色譜條件,以色譜峰的保留時(shí)間定性,外標(biāo)峰面積法定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的考察

甘草酸易溶于熱水、醇等極性溶液，幾乎不溶于乙醚。在方法研究時(shí)，對(duì)肉制品中甘草酸的提取用10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、流動(dòng)相等作為溶劑進(jìn)行提取比較，提取結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑的提取結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)可知，當(dāng)使用流動(dòng)相作為提取液進(jìn)行提取時(shí)，提取率最高，因此采用流動(dòng)相作為提取液。

2.2 樣品前處理方法的考察

針對(duì)含油脂及蛋白質(zhì)量較多的肉制品，采用加沉淀劑法去除干擾，試驗(yàn)中分別加沉淀劑乙酸鋅－亞鐵氰化鉀溶液 0.0，2.0，5.0m L 進(jìn)行比較分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)沉淀劑添加量為0.0m L時(shí)，干擾峰較多；當(dāng)添加量為2.0m L和5.0m L時(shí)，干擾峰較少，而甘草酸的回收率在可接受范圍內(nèi)，選擇沉淀劑添加量為 2.0m L。

2.3 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對(duì)甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外光譜檢測。從甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰最高點(diǎn)提取的三維光譜圖發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品在250nm附近有最大特征吸收。因此實(shí)驗(yàn)選擇250nm作為甘草酸的檢測波長。

2.4 流動(dòng)相的選擇

甘草酸因含有羧基而顯酸性，因此在流動(dòng)相中加入少量酸性改性劑可以增加流動(dòng)相的極性，降低待測物在色譜柱上的保留時(shí)間，以改善峰形；同時(shí)，在流動(dòng)相中添加適量乙酸銨緩沖鹽能抑制樣品的電離，穩(wěn)定樣品和pH值，優(yōu)化色譜系統(tǒng)，為樣品的鍵合提供良好的環(huán)境，使峰型更好。實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水-磷酸、甲醇-水-甲酸、甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰乙酸等不同體系和比例流動(dòng)相下樣品的分離情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰乙酸（70∶29∶1）時(shí)，樣品分離較好，響應(yīng)值較高，且此時(shí)流動(dòng)相的pH值亦在色譜柱的耐酸范圍內(nèi)。

圖1 肉類樣品中甘草酸的色譜圖

2.5 色譜柱的選擇

根據(jù)甘草酸的性質(zhì)及色譜柱的類別，對(duì)C8、C18等色譜柱進(jìn)行分析比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)C18色譜柱的分離效果最好。

2.6 線性方程及檢出限

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量配制 1.0，10.0，20.0，40,0，80.0μg/m L系列濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，甘草酸濃度在1.0～80.0μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為 y=8.55×10-5x–0.599（r=0.999 7）。

同時(shí)選定 3 個(gè)低濃度 2.0，4.0，10.0μg/m L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)每一濃度水平分別重復(fù)測定6次，求出每個(gè)濃度測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s1，s2，s3，用線性回歸法作回歸曲線，求出濃度為零時(shí)空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差s0。定義3s0所對(duì)應(yīng)的濃度為方法的檢出限，10s0所對(duì)應(yīng)的濃度為方法的定量限，得出本方法的檢出限為 1.0mg/kg，定量限為 3.0mg/kg。

2.7 回收試驗(yàn)

隨機(jī)抽取本底值為零的市售醬牛肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每一樣品平行測定6次，結(jié)果見表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見，該方法測定的加標(biāo)回收率為95.7%～103.4%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%～3.53%（n=6）?；厥章实臏y定結(jié)果符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[9]中表F.1中要求。

2.8 精密度試驗(yàn)

隨機(jī)抽取一市售醬牛肉按1.3法進(jìn)行處理，重復(fù)測定6次，測定結(jié)果為30.869 2，29.562 5，29.954 6,30.258 9，30.104 6，28.996 8 μg/m L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[9]中表F.3中要求。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對(duì)含甘草酸濃度為 10.0，40.0，80，200.0μg/m L的溶液分別進(jìn)行4次重復(fù)分析,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，測定含量（經(jīng)回收率校正）平均值與真值的偏差為-4.7%～3.20%，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[9]中表F.5中要求。

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了用高效液相色譜儀測定肉制品中甘草抗氧化物含量方法，該方法準(zhǔn)確度高、靈敏度好、檢出限低、實(shí)用性強(qiáng)，適合于檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)日常檢驗(yàn)工作中大批量肉制品中甘草抗氧化物含量的測定。

[1] 徐樹蕓，王海寧.HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36(24):10297-10300.

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[3] GB 2760-2010食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[4] ISO 11023-1999 Liquorice extracts (Glycyrrhiza glabra L.)-Determ ination of glycyrrhizic acid content - Method using highperformance liquid chromatography [S].

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Determ ination of Antioxidants Licorice in M eat by High-Performance Liquid Chromatography

Tan Botao, Hao Yuanyuan, Ding Yicong
( Fuyang Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Fuyang 236112，China )

A method for determ ination of the antioxidants licorice in meat was established. The samples were extracted by the mobile phase, separated by C18column. Methanol-0.2 mol/L ammonium acetate-acetic acid (volume ratio was 70∶29∶1) was as mobile phase w ith the fl ow rate of 1.0m L/m in. The sample was qualitatived by the retention time and quantitatived by the peak area, the detection wavelenth was 250nm. The calibration curve was linear in the range of 1.0-80μg/m L, r=0.999 7. The limit of the detection was 1.0mg/kg, the limit of quantifi cation was 3.0mg/kg, the recovery ranged from 95.7% to 103.4%and the RSD was 1.57%-3.53%（n=6）. This method is suitable for the determ ination of antioxidants licorice in meat for routine inspection work.

high performance liquid chromatography; meat; antioxidants licorice

O657.7+2；TS207.3

A

1008-6145(2012)01-0040-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.012

* 2010年安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZJY-018)

聯(lián)系人：郝媛媛；E-mail:446903913@qq.com

2011-10-25