石志紅 張慧峰

[摘要] 目的：通過測定慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者肺組織中水通道蛋白5（AQP）、鈉泵α1亞單位蛋白的表達(dá)及與肺功能變化的關(guān)系，明確AQP5、鈉泵α1亞單位在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：選取肺葉切除術(shù)患者肺組織標(biāo)本52例，其中，對照組25例，COPD組27例；免疫組化法檢測AQP5、鈉泵α1亞單位蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，AQP5蛋白在COPD組表達(dá)降低（P＜0.05），在COPD中度組較輕度組表達(dá)亦降低，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AQP5表達(dá)改變與FEV1/FVC、FEV1預(yù)計(jì)值呈正相關(guān)關(guān)系（Rs=0.717，P＜0.05；Rs=0.500，P＜0.01）。鈉泵α1亞單位在COPD組患者的表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：AQP5參與了COPD患者氣道黏液分泌的病理過程并與COPD氣流受限有關(guān)，鈉泵α1亞單位在COPD的發(fā)病機(jī)制中可能起輔助作用。

[關(guān)鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病；水通道蛋白5；鈉泵；黏液纖毛功能障礙

[中圖分類號(hào)] R563[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2011）11（c）-031-03

Changes and clinical significance of the expression of Aquaporin 5 and sodium pump α1 subunit in the airway of patients with chronic obstructive pulmonary disease

SHI Zhihong1, ZHANG Huifeng2

1.Department of Respiration Medicine, the First Affiliated Hospital of Medical College in Xi′an Jiaotong University, Shaanxi Province, Xi′an 710061, China; 2.Department of Intensive Medicine (ICU), He′nan Provincal People′s Hospital, Zhengzhou 450003, China

[Abstract] Objective: To study the role of AQP5 and sodium pump α1 subunit in development of COPD by measuring AQP5 and sodium pump α1 subunit protein expression and their relationships with pulmonary function changes in COPD patients. Methods: The sample from 52 cases of pulmonary lobectomy patients, including 25 cases of control group and 27 cases of COPD group, each sample was stained by immunohistochemical staining to detect AQP5 and sodium pump α1 subunit protein expression. Results: Compared with the control group, AQP5 protein expression decreased in the COPD group (P<0.05); moreover, compared with mild group, AQP5 also decreased in moderate COPD group (P<0.05). Change of AQP5 expression was positively correlated with predicted values of FEV1/FVC and FEV1 (Rs=0.717, P<0.05; Rs=0.500, P<0.01); sodium pump α1 subunit expression in COPD patients showed no significant difference compared with the control group (P>0.05). Conclusion: AQP5 participates in pathological process of airway mucus secretion in COPD patients and has the relationgship with airway obstruction of COPD; sodium pump α1 subunit may play a minor role in the pathogenesis of COPD.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease; Aquaporin 5; Sodium pump; Mucociliary dysfunction

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，COPD的氣道炎癥、結(jié)構(gòu)改變和黏液纖毛功能障礙等可引起氣流受限導(dǎo)致肺功能下降，臨床癥狀加重和健康狀態(tài)惡化[1]。氣道黏液纖毛清除功能障礙是COPD的一個(gè)重要病理生理改變，促進(jìn)了COPD的發(fā)生、發(fā)展。水通道蛋白5（Aquaporin 5，AQP5）、鈉泵是氣道上皮主要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，與氣道表面液體（aairway surface liquid，ASL）的分泌和調(diào)節(jié)有密切關(guān)系，本研究以COPD患者手術(shù)標(biāo)本為研究對象，探討肺組織中AQP5、鈉泵α1亞單位蛋白的表達(dá)及與肺功能變化的關(guān)系，明確兩者在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺組織標(biāo)本來源于我院胸外科和腫瘤外科2005年4月～2006年4月因肺部腫瘤行肺葉切除術(shù)的患者。所取肺組織均距離腫瘤病變3 cm以上；依據(jù)術(shù)前1周的肺功能檢查分為COPD組和對照組，COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2008年全球慢性阻塞性肺疾病防治倡議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）。對照組為肺癌患者未合并慢性呼吸系統(tǒng)疾病且行肺功能測試正常者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將所取肺組織經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片，烤片過夜。分別按照AQP5及鈉泵α1免疫組化試劑盒說明進(jìn)行操作，分別設(shè)立陽性對照及陰性對照，光鏡下觀察，半定量積分法，即對每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行分級(jí)記分，然后根據(jù)兩項(xiàng)之和確定其陽性強(qiáng)度[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

兩組比較采用單因素方差分析或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般情況

COPD組男22例，女5例；平均年齡（58.41±10.37）歲；平均吸煙量566.67支/年。對照組男21例，女4例；平均年齡（54.24±10.03）歲；平均吸煙量426.00支/年。兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 AQP5在兩組患者肺組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，AQP5主要分布在纖毛上皮柱狀細(xì)胞的頂膜面、黏膜下腺體、肺泡上皮細(xì)胞；其在COPD組顯示，低表達(dá)19例、中表達(dá)6例、無高表達(dá)，陽性表達(dá)率為92.6%；對照組低表達(dá)5例、中表達(dá)14例、高表達(dá)6例，陽性表達(dá)率為100.0％，兩組陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

對AQP5在兩組患者組織中免疫組化染色蛋白表達(dá)強(qiáng)度的半定量分析結(jié)果進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，AQP5在COPD組表達(dá)較對照組明顯減低，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

對AQP5在不同嚴(yán)重程度（輕度和中度）COPD中的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步進(jìn)行分層分析顯示：COPD中度組AQP5表達(dá)強(qiáng)度較輕度組減低，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

將AQP5在組織中的表達(dá)強(qiáng)度與COPD主要?dú)饬髯枞笜?biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：AQP5的表達(dá)強(qiáng)度與FEV1/FVC（1 s率）、FEV1預(yù)計(jì)值（1 s量占預(yù)計(jì)值的百分比）成呈相關(guān)關(guān)系（Rs=0.717，P＜0.05；Rs=0.500，P＜0.01），即AQP5蛋白表達(dá)可能與患者氣流受限的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。氣流受限程度越重，AQP5表達(dá)越少。

2.3 鈉泵α1亞單位在兩組患者肺組織中的表達(dá)

鈉泵α1亞單位主要表達(dá)在氣道纖毛上皮細(xì)胞基底膜，黏膜下腺體、肺泡上皮細(xì)胞也有少量表達(dá)。其在COPD組低表達(dá)16例，中表達(dá)5例，無高表達(dá)，陽性表達(dá)率為77.8%；對照組中低表達(dá)11例，中表達(dá)9例，低表達(dá)1例，陽性表達(dá)率為84.0％，兩組陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

對鈉泵α1亞單位在不同嚴(yán)重程度（輕度和中度）COPD中的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步進(jìn)行分層分析顯示：COPD中度組鈉泵α1亞單位表達(dá)強(qiáng)度較輕度組減低，但兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。進(jìn)一步分析顯示，鈉泵α1亞單位表達(dá)強(qiáng)度與COPD病情嚴(yán)重程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。鈉泵α1亞單位的表達(dá)強(qiáng)度與FEV1/FVC、FEV1預(yù)計(jì)值間的相關(guān)系數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Rs= 0.167、0.015，P＞0.05）。

2.4 AQP5與鈉泵α1亞單位的免疫組化表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性

AQP5與鈉泵α1亞單位的免疫組化表達(dá)強(qiáng)度積分進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)為Rs=0.186，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

氣道黏液纖毛清除功能障礙是COPD重要的病理生理特點(diǎn)之一。目前對COPD黏液纖毛功能障礙的研究主要集中在杯狀細(xì)胞和黏膜下腺黏液性細(xì)胞對黏蛋白的分泌和黏液素基因?qū)︷さ鞍椎谋磉_(dá)調(diào)控方面。而黏蛋白的分泌與水、電解質(zhì)的分泌是相互調(diào)節(jié)的，與水、電解質(zhì)密切相關(guān)的離子通道主要有鈉離子通道、鈉泵、AQP。其中AQP5是黏膜下腺體液體分泌的主要參與者，黏膜下腺AQP5的減少可以導(dǎo)致氣道液體分泌的減少和黏蛋白濃度增加[3]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到AQP5主要分布在支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞的頂膜面、黏膜下腺體、肺泡上皮細(xì)胞，這與既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[4]；通過AQP5蛋白表達(dá)部位可以看出AQP5在肺內(nèi)與腺體分泌、氣道及肺內(nèi)液體清除、正常呼吸道氣道表面液體（ASL）的形成均有密切關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)COPD患者氣道纖毛柱狀上皮細(xì)胞、黏膜下腺體AQP5的表達(dá)較對照組均降低。說明AQP5可能參與了COPD患者氣道黏液分泌的病理過程，AQP5表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致黏液分泌中水分減少，周圍纖毛層減少，纖毛擺動(dòng)頻率、振幅降低，同時(shí)由于AQP5表達(dá)的減少可以導(dǎo)致分泌液中蛋白濃度增加，分泌物更黏稠，使黏液清除減少，引起病原菌在呼吸道的駐留和繁殖，誘發(fā)或加重感染，進(jìn)一步刺激黏液高分泌，如此形成惡性循環(huán)，成為COPD發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

本研究結(jié)果還顯示，AQP5的表達(dá)強(qiáng)度與FEV1/FVC、FEV1預(yù)計(jì)值呈正相關(guān)關(guān)系，即AQP5表達(dá)可能與患者氣流受限的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，AQP5表達(dá)越弱，引起氣流受限程度越重，反之越輕，說明AQP5表達(dá)改變引起的患者氣道黏液分泌異常作為重要的病理生理過程，參與了COPD特征性改變——?dú)饬魇芟薜男纬珊桶l(fā)展，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[5]?；A(chǔ)研究表明，腫瘤壞死因子α（TNF-α）可通過下調(diào)AQP5 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而影響小鼠慢性支氣管炎氣道表面液體層的水代謝[6]；鹽酸氨溴索可通過抑制TNF-α的釋放而上調(diào)AQP5的表達(dá)，從而達(dá)到治療COPD的目的[7]；因此，調(diào)節(jié)AQP5的功能及表達(dá)，可作為治療COPD新的切入點(diǎn)[8]。通過調(diào)節(jié)其表達(dá)，將有助于改善COPD氣道分泌物組成成分，糾正COPD黏液纖毛清除功能障礙，有望緩解COPD患者的氣道高分泌，減輕氣流受限程度，從而延緩COPD的病程進(jìn)展。

氣道內(nèi)液體平衡調(diào)節(jié)的另一個(gè)主要參與者鈉泵基因的表達(dá)和鈉泵活性與氣道的許多生理、病理功能改變有關(guān)，如鈉泵活性受抑與氣道高反應(yīng)性、氣道的重建、氣道平滑肌張力等有關(guān)[9-10]，且鈉泵在肺囊性纖維化、哮喘急性發(fā)作時(shí)均有活性改變；而鈉泵α1亞單位是鈉泵的主要活性單位，其在成人氣道內(nèi)的分布以及在COPD狀態(tài)下的改變需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鈉泵α1亞單位主要分布在支氣管柱狀纖毛上皮細(xì)胞的基底膜側(cè)，黏膜下腺體、肺泡上皮細(xì)胞也可見表達(dá)。說明鈉泵主要參與ASL的調(diào)節(jié)，對ASL的形成、肺內(nèi)液體清除也起著一定的作用。與對照組相比，COPD組鈉泵表達(dá)減弱，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在輕、中度組中表達(dá)差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與肺功能、吸煙量及AQP5的表達(dá)做相關(guān)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果與鈉泵在其他疾病的研究結(jié)果中不一致。COPD的常見誘因脂多糖（LPS）亦可以誘導(dǎo)氣道鈉泵亞單位的表達(dá)增加[1]，囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）患者與正常支氣管相比鈉泵活性增加，認(rèn)為此改變繼發(fā)于鈉重吸收增多[11]。據(jù)以往的研究和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明鈉泵在COPD的發(fā)病機(jī)制中可能起著一定的輔助作用，尚需大樣本、多個(gè)亞單位和多種方法的研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，AQP5及鈉泵均參與了氣道內(nèi)液體平衡的調(diào)節(jié)，其中AQP5在COPD患者中表達(dá)減低，與FEV1/FVC、FEV1預(yù)計(jì)值成正相關(guān)關(guān)系，研究提示AQP5參與了COPD患者氣流受限的形成和發(fā)展過程；鈉泵α1亞單位則可能僅在COPD的發(fā)病機(jī)制中起輔助推動(dòng)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Dodrill MW, Beezhold DH, Meighan T, et al. Lipopolysaccharide increases Na(+), K(+)-pump, but not ENaC, expression in guinea-pig airway epithelium [J]. Eur J Pharmacol,2011,651(1-3):176-186.

[2]邢傳平,劉斌,董亮.免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法[J].中華病理學(xué)雜志,2001,30(4):318.

[3]Wang K, Feng YL, Wen FQ, et al. Decreased expression of human aquaporin-5 correlated with mucus overproduction in airways of chronic obstructive pulmonary disease [J]. Acta Pharmacol Sin,2007,28(8):1166-1174.

[4]Matsuzaki T, Hata H, Ozawa H, et al. Immunohistochemical localization of the aquaporins AQP1, AQP3, AQP4, and AQP5 in the mouse respiratory system [J]. Acta Histochem Cytochem,2009,42(6):159-169.

[5]Hansel NN, Sidhaye V, Rafaels NM, et al. Aquaporin 5 polymorphisms and rate of lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease [J]. Plos One,2010,5(12):e14226.

[6]Towne JE, Krane CM, Bachurski CJ. Tumor necrosis factor-α inhibits aquaporin 5 expression in mouse lung epithelial cells [J]. Biol Chem, 2001,276(22):18657-18664.

[7]歐陽金生,劉少濱.脂多糖煙霧誘導(dǎo)慢性支氣管炎大鼠模型水通道5表達(dá)與腫瘤壞死因子α、白介素13、白三烯B4的變化[D].福州:福建醫(yī)科大學(xué),2006.

[8]Shen Y, Chen Z, Wang Y, et al. Aquaporin 5 expression inhibited by LPS via p38/JNK signaling pathways in SPC-A1 cells [J]. Respir Physiol Neurobiol,2010,171(3):212-217.

[9]Campos-Bedolla P, Vargas MH, Segura P, et al. Airway smooth muscle relaxation induced by 5-HT (2A) receptors: role of Na(+)/K(+)-ATPase pump and Ca(2+)-activated K(+) channels [J]. Life Sci,2008,83(11-12):438-446.

[10]Mazzone SB, Reynolds SM, Mori N, et al. Selective expression of a sodium pump isozyme by cough receptors and evidence for its essential role in regulating cough [J]. J Neurosci,2009,29(43):13662-13671.

[11]Miller TJ, Davis PB. FXYD5 modulates Na+ absorption and is increased in cystic fibrosis airway epithelia [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2008,294(4):654-664.

（收稿日期：2011-09-09）