吳介恒，盧興兵，李榮妍，呂智慧，黃莎圓子，劉夢(mèng)娜，郭素紅

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林 132013)

胰腺癌是一種惡性程度很高且以早期轉(zhuǎn)移為突出特征的腫瘤,其發(fā)病率在近年呈逐年上升趨勢(shì)。臨床上尚無(wú)經(jīng)濟(jì)、有效的早期發(fā)現(xiàn)方法[1-2]。 而造模是研究胰腺癌的基礎(chǔ)，因此建立合適的人胰腺癌動(dòng)物模型對(duì)胰腺癌的治療研究起著十分重要的作用[3]。但目前仍沒有一種完全可行的胰腺癌動(dòng)物模型的制作方法。本文通過對(duì)SD雄性大鼠每天灌服硫唑嘌呤(AZA)，皮下移植胰腺癌細(xì)胞的方法，來尋找最適合成瘤的AZA濃度，從而建立一種成瘤率高、操作簡(jiǎn)單方便的胰腺癌造模方法。

1 材料與方法

1.1材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株：清潔級(jí)，雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量 180～200 g，購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；Mia PACAⅡ胰腺癌細(xì)胞株由吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院饋贈(zèng)。(2)實(shí)驗(yàn)用品：DMEM低糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自Gibco公司；新生胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；大鼠CA24-2 ELISA 96T試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；一次性真空采血管(EDTA-K2抗凝)購(gòu)自湖南瀏陽(yáng)三力集團(tuán)；CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、微量天平由吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院提供。(3)AZA：購(gòu)自上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將剛復(fù)蘇的Mia PACAⅡ胰腺癌細(xì)胞接種在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，平均每3～4 d傳代1次處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Mia PACAⅡ細(xì)胞見封2圖1。

1.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)的原則，按照AZA的濃度梯度對(duì)所購(gòu)買的40只SD大鼠進(jìn)行分組：空白對(duì)照組(A組)、2.6 mg/kg AZA組(B組)、2.2 mg/kg AZA組(C組)、1.8 mg/kg AZA組(D組)、1.4 mg/kg AZA組(E組)，每組8只。A組每天灌服2 mL生理鹽水，B、C、D、E組每天灌服相應(yīng)濃度的AZA生理鹽水液2 mL。

1.2.3移植實(shí)驗(yàn) 在大鼠灌胃30 d后 ，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Mia PACAⅡ細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化，用非完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞密度為3×105個(gè)/0.2 mL的細(xì)胞懸液，用乙醚麻醉大鼠后，于大鼠右側(cè)腋窩處，皮下移植0.2 mL Mia PACAⅡ細(xì)胞懸液。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè) 在移植后第15、 20、 25、30天采集大鼠血漿進(jìn)行CA24-2檢測(cè)，CA24-2檢測(cè)采用由美國(guó)R&D公司生產(chǎn)的生物素-親和素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(BSA-ELISA)中直接BA法進(jìn)行檢測(cè)，然后用DNM-9602型酶標(biāo)儀，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度(OD)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。

1.2.5大鼠狀態(tài)觀察 移植細(xì)胞后，每天對(duì)SD大鼠飲食和活動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.6病理檢查 在移植后的第30天斷頸處死大鼠，取出其胰腺組織和腋窩下淋巴結(jié)，置于4%多聚甲醛中固定，然后用HE染色并制成石蠟切片，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀況觀察 在移植Mia PACAⅡ細(xì)胞細(xì)胞懸液后，各組大鼠的活動(dòng)減少、進(jìn)食減少，質(zhì)量減輕；在移植細(xì)胞后的第15天，大鼠質(zhì)量、進(jìn)食、活動(dòng)進(jìn)一步下降，在給藥的第30天，B、C、D、E組各有2只SD大鼠死亡。

2.2CA24-2檢測(cè) 通過對(duì)各組大鼠體內(nèi)CA24-2檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，B、C、D、E組均為陽(yáng)性結(jié)果，在移植后的第15、20、25、30天B組大鼠體內(nèi)CA24-2水平分別為(51.56±2.14)、(51.61±1.21)、(54.66±1.02)、(56.00±0.38)U/mL，與C、D、E組相對(duì)應(yīng)的移植時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B、C、D、E組在移植后第15、20、25、30天大鼠體內(nèi)CA24-2的含量與A組(3.35±0.38)U/mL比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著移植時(shí)間的增加，B、C、D組大鼠體內(nèi)CA24-2水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E組在移植后第15、20、25、30天時(shí)，大鼠體內(nèi)CA24-2的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血漿中CA24-2水平比較(U/mL)

2.3病理學(xué)檢查 在高倍視野下觀察發(fā)現(xiàn)，胰腺組織的正常結(jié)構(gòu)消失，被纖維組織替代，腫瘤細(xì)胞呈彌漫狀分布，腫瘤細(xì)胞排列均勻。在油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)大小不等且畸形，細(xì)胞核大，核深染，可見1～2個(gè)核仁及雙核(封2圖2～6)。其中，B組有5只、C組有3只、D組有2只、E組有1只大鼠有上述改變，A組無(wú)任何異常變化，見封2圖7。

2.4各組大鼠成瘤率比較 B組成瘤率為83.3%(5/6)， 3只出現(xiàn)腋窩下單個(gè)淋巴結(jié)和胰腺周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；C組成瘤率為50.0%(3/6)；D組成瘤率為33.3%(2/6)； E組成瘤率為16.7%(1/6)。

3 討 論

腫瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤的前提，理想的腫瘤動(dòng)物模型應(yīng)該包含以下內(nèi)容:(1)致癌的方法簡(jiǎn)單易行；(2)經(jīng)濟(jì)快速；(3)指標(biāo)客觀明確；(4)對(duì)癌變器官的特異性高；(5)重復(fù)性好；(6)誘發(fā)腫瘤的病理類型、生物學(xué)行為、電鏡下表現(xiàn)及組織化學(xué)改變與人體腫瘤相似[4]。從 20世紀(jì) 70年代用化學(xué)方法誘導(dǎo)制作出胰腺癌動(dòng)物模型以來,經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展,各國(guó)學(xué)者又設(shè)計(jì)出了多種制作胰腺癌動(dòng)物模型的方法，包括手術(shù)方法、同位移植、異位移植和基因工程等方法[5]。但目前這些造模方法都存在一定的缺點(diǎn)，手術(shù)造模的方法，大鼠成瘤周期長(zhǎng)、成瘤率低，且在手術(shù)操作和麻醉中均會(huì)造成大鼠不必要的死亡。Clapper等[6]利用敘利亞倉(cāng)鼠腹腔內(nèi)注入致癌劑,但同時(shí)伴發(fā)了胃癌和肝癌。因此,化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的方法造出的胰腺癌模型，其特異性不高。此外，目前移植造模大多采用裸鼠，但由于裸鼠飼養(yǎng)條件要求高，同時(shí)造模實(shí)驗(yàn)成本較高，故難以得到普遍利用[6]。由于皮下移植瘤模型具有操作簡(jiǎn)單，成瘤時(shí)間短，腫瘤生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)[7]，同時(shí)，AZA為免疫抑制劑，能抑制體內(nèi)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的生物學(xué)功能，對(duì)大鼠成瘤有一定的促進(jìn)作用[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)大鼠每天灌服AZA和皮下移植胰腺癌細(xì)胞的方法進(jìn)行大鼠胰腺癌模型的制作。

目前，臨床上常用于診斷胰腺癌的腫瘤標(biāo)記物指標(biāo)有：CA24-2、CA19-9，但隨著CA19-9檢測(cè)的廣泛開展,發(fā)現(xiàn)其特異性正在下降,一些非胰腺癌性疾病也存在CA19-9顯著升高,常致臨床診斷的誤導(dǎo)[9]。CA24-2是一種糖類抗原[10],在胃腸及胰腺?gòu)V泛存在,它可補(bǔ)充CA19-9的不足[9]，CA24-2在胰腺癌預(yù)后判斷中比CA19-9可能更具價(jià)值[11]。此外，病理切片是診斷疾病的主要手段之一[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)大鼠體內(nèi)CA24-2水平檢測(cè)和胰腺組織病理切片的觀察來判斷SD大鼠是否成瘤。通過計(jì)算各組SD大鼠胰腺癌成瘤率，成功篩選出最適合大鼠成瘤的AZA濃度。當(dāng)AZA濃度為2.6 mg/kg時(shí)，成瘤率最高，為83.3%。

另外，實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)出現(xiàn)一些干擾因素，而影響SD大鼠成瘤，本研究認(rèn)為：(1)應(yīng)盡量選用雄性大鼠， 因?yàn)榇剖篌w內(nèi)存在雌激素，雌激素具有免疫增強(qiáng)的作用[13]。(2)Mia PACAⅡ細(xì)胞在傳代過程中，用胰蛋白酶消化的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則將影響移植的成功率。(3)應(yīng)該選擇狀態(tài)好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于移植[14]，同時(shí)，在培養(yǎng)中應(yīng)避免污染的發(fā)生[15]。(4)移植的部位最好選擇在前肢皮下，這樣可以避免其他大鼠碰觸移植部位。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用灌服免疫抑制劑和皮下接種細(xì)胞懸液的方法構(gòu)建大鼠胰腺癌動(dòng)物模型。該種方法具有操作簡(jiǎn)便、成瘤時(shí)間短、成瘤率高、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，

是較為理想和實(shí)用的胰腺癌動(dòng)物模型，該造模方法為后續(xù)進(jìn)行胰腺癌發(fā)病機(jī)制及治療研究等實(shí)驗(yàn)提供了良好的平臺(tái)。

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