肖衛(wèi)華，陳佩杰

IGF－1和MGF在過度訓(xùn)練抑制大鼠腹膜巨噬細(xì)胞吞噬功能中的作用研究

肖衛(wèi)華1，2，陳佩杰1

目的：觀察過度訓(xùn)練對大鼠腹膜巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響及胰島素樣生長因子1（IGF－1）和機(jī)械生長因子（MGF）在其中所起的作用。方法：8周齡健康雄性Wistar大鼠16只，隨機(jī)分為安靜對照組（control）和過度訓(xùn)練組（overtraining）。過度訓(xùn)練組進(jìn)行11周遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練。最后1次訓(xùn)練后36h，記錄體重變化并測定血液中血紅蛋白和睪酮含量。斷頭處死大鼠并分離純化腹膜巨噬細(xì)胞，中性紅法測定巨噬細(xì)胞吞噬功能，熒光定量PCR技術(shù)測定IGF－1和MGF基因表達(dá)。離體狀態(tài)下用不同濃度的IGF－1或MGF與巨噬細(xì)胞孵育2h，觀察IGF－1和MGF對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。結(jié)果：與安靜對照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠體重、血紅蛋白和睪酮含量均顯著降低，分別下降了約19.3%（P＜0.01）、13.5%（P＜0.01）、55.3%（P＜0.01）。過度訓(xùn)練組巨噬細(xì)胞攝取中性紅能力顯著低于安靜對照組，下降約27%（P＜0.05）；過度訓(xùn)練組巨噬細(xì)胞IGF－1mRNA水平約為安靜對照組的21倍（P＜0.01），MGF mRNA水平約為安靜對照組的92倍（P＜0.01）；IGF－1對巨噬細(xì)胞吞噬功能無顯著影響，各濃度組與未加藥組相比均無顯著性差異（P＞0.05）；MGF呈濃度依賴性的抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能，與未加藥組相比，10ng／ml、50ng／ml組有顯著性差異（P＜0.05），100ng／ml、200ng／ml組有極顯著性差異（P＜0.01），各濃度組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論：過度訓(xùn)練抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能；過度訓(xùn)練誘導(dǎo)產(chǎn)生的MGF可能在過度訓(xùn)練抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

過度訓(xùn)練；巨噬細(xì)胞；吞噬功能；胰島素樣生長因子1；機(jī)械生長因子；鼠；動物實驗

規(guī)律性的身體活動可以提高免疫機(jī)能，降低感染風(fēng)險；而長時間、大強(qiáng)度運動則使感染幾率增加［16，22］。巨噬細(xì)胞在控制感染過程中發(fā)揮重要作用，是機(jī)體抵御病菌入侵的第一道防線。巨噬細(xì)胞廣泛分布于肺、肝、腎、腹腔、肌肉、血液等組織器官，具有吞噬、殺菌、抑制腫瘤、抗原遞呈、分泌炎性因子等多種功能［17］。吞噬作用是巨噬細(xì)胞最為重要的功能之一，可吞噬入侵的病菌及清除凋亡的機(jī)體細(xì)胞。有關(guān)運動與巨噬細(xì)胞吞噬功能的研究表明，長期中低強(qiáng)度運動或短期劇烈運動均能提高巨噬細(xì)胞吞噬功能［8，9，23］，但過度訓(xùn)練如何影響巨噬細(xì)胞吞噬功能未見相關(guān)研究。此外，運動影響巨噬細(xì)胞吞噬功能的相關(guān)機(jī)制鮮見報道。

研究表明，IGF－1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF－α［21］和IL－1β［24］等炎性因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝取和降解低密度脂蛋白［13］，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向炎癥部位遷移參與炎癥反應(yīng)［10］，調(diào)控巨噬細(xì)胞的分化和存活［19］等多種功能。但I(xiàn)GF－1是否參與巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)控，未見相關(guān)報道。此外，IGF－1前體選擇性剪接能產(chǎn)生多種異構(gòu)體，如IGF－1Ea、IGF－1Eb等，IGF－1Ea即為研究者常稱的IGF－1，IGF－1Eb在嚙齒類動物中又被稱為“機(jī)械生長因子”（mechano growth factor，MGF）［25］。MGF功能有別于IGF－1，具有增加肌肉體積和肌肉力量等多種功能，且MGF促進(jìn)肌肉體積增大的效應(yīng)遠(yuǎn)大于IGF－1［7］。此外，MGF可不通過IGF－1受體途徑發(fā)揮作用［26］。因此，MGF已經(jīng)成為了體育界的研究熱點［2，5，6］。安靜狀態(tài)下肌肉中IGF－1和MGF呈低豐度表達(dá)，大強(qiáng)度運動可誘導(dǎo)其急劇增加［12］。報道顯示，巨噬細(xì)胞能表達(dá)IGF－1［10］，但能否表達(dá)MGF及是否受大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)，未見相關(guān)報道。此外，MGF是否參與巨噬細(xì)胞功能調(diào)控，尚未見相關(guān)資料。

據(jù)此，本文提出如下假設(shè)：過度訓(xùn)練可能通過抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能從而降低免疫細(xì)胞功能，增加感染幾率；巨噬細(xì)胞中IGF－1和MGF表達(dá)可能與肌肉中相似，即在大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)下表達(dá)量急劇增加，通過自分泌或旁分泌形式參與巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)控。為驗證這一假設(shè)，本文通過建立過度訓(xùn)練模型，以腹膜巨噬細(xì)胞為對象并結(jié)合離體實驗展開相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠［中國科學(xué)院上海實驗動物中心／上海斯萊克實驗動物有限公司，SCXK（滬）2007－0005］；RPMI1640，胎牛血清（GIBCO，美國）；青霉素－鏈霉素溶液（碧云天生物技術(shù)研究所）；中性紅（Amersco，美國）；睪酮ELISA試劑盒（R＆D Systems，美國）；Trizol（invitrogen，美國）；cDNA合成試劑盒，熒光定量PCR試劑盒（Fermentas，立陶宛）；重組IGF－1（Sigma Aldrich，美國）；MGF多肽（上海吉爾生化有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，美國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。大鼠跑臺（DSPT－202跑臺，杭州段氏制作公司）；血細(xì)胞分析儀（Sysmex，日本）；梯度PCR儀（Eppendorf，德國）；Rotor－Gene 3000熒光定量PCR儀（Corbett，澳大利亞）；酶標(biāo)儀（Bio－Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組

8周齡健康雄性Wistar大鼠16只，體重180±10g。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22℃±2℃，相對濕度50%～70%，每天光照時間為12h，自由飲食。將大鼠隨機(jī)分為安靜對照組（control）和過度訓(xùn)練組（overtraining），每組8只。

1.2.2 過度訓(xùn)練方案

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，過度訓(xùn)練組開始進(jìn)行遞增負(fù)荷的跑臺訓(xùn)練，每周6次，周日休息，共訓(xùn)練11周。過度訓(xùn)練方案參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行［14］（表1）。

1.2.3 過度訓(xùn)練模型驗證

觀察大鼠精神狀況及運動能力的變化，且在最后1次訓(xùn)練后36h，記錄各組體重，并眼眶取血收集血液樣本。血細(xì)胞分析儀測定血紅蛋白含量。競爭法ELISA測定血清睪酮含量，操作流程按產(chǎn)品說明書。

1.2.4 腹膜巨噬細(xì)胞分離與純化

采用文獻(xiàn)方法［4，20］進(jìn)行并略作修改。眼眶取血后斷頭處死大鼠，腹腔注射12ml RPMI1640培養(yǎng)液，腹部按摩2 min后靜置5min，在腹部做約2cm長開口并小心吸取腹腔灌洗液入離心管。離心去上清，PBS洗2遍后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并移入6孔板，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2h，傾去不貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞，PBS（pH 7.4）輕柔洗滌2次后加入PBS小心吹打細(xì)胞入離心管，離心去上清后用RP－MI1640重懸細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)濃度至2×106個／ml。

1.2.5 吞噬功能的測定

中性紅法測定巨噬細(xì)胞吞噬功能［15］。取100μl上述細(xì)胞懸液至96孔板，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2h后，棄上清，加入200μl含0.1%中性紅溶液孵育30min，PBS洗3次后，加入無水乙醇和冰醋酸混合液（1∶1）200 μl并混勻，10min后于酶標(biāo)儀上測定550nm吸光度。吸光度即代表巨噬細(xì)胞吞噬功能。

表1 本研究過度運動方案一覽表Table 1 Overtraining Protocol

1.2.6 RNA抽提與cDNA合成

離心收集剩余的細(xì)胞。使用異硫氫酸胍－氯仿經(jīng)典法抽提總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：65℃，5min；4℃，2 min；25℃，5min；42℃，60min；70℃，5min。反應(yīng)總體積20μl，合成的cDNA儲存在－20℃?zhèn)溆茫?］。

1.2.7 熒光定量PCR

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列，設(shè)計目的基因IGF－1和MGF及內(nèi)參基因β－actin的熒光定量引物（表2），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。雙標(biāo)曲法相對定量PCR，定量PCR反應(yīng)液包括：MaximaTMSYBR Green／ROX qPCR Master Mix（2×），12.5μl；上、下游引物各0.75μl（10μM）；模板cDNA，1μl；DEPC水，10μl；總計25μl體積。反應(yīng)條件采用兩步法：50℃，2 min；95℃，10min；95℃（15s），60℃（60s），40個循環(huán)。IGF－1和MGF基因在1～105units范圍內(nèi)，檢測閾值（CT）與拷貝數(shù)對數(shù)呈線性關(guān)系，兩者相關(guān)系數(shù)r＞0.99。熔解曲線分析顯示二者均呈單一產(chǎn)物峰。

1.2.8 離體實驗

取180g左右Wistar大鼠12只，按1.2.4所示分離純化腹膜巨噬細(xì)胞。所有純化的巨噬細(xì)胞混合重懸于無血清的RPMI1640中（含1%青霉素－鏈霉素溶液），調(diào)細(xì)胞濃度至2×106個／ml。取100μl至96孔板，無血清培養(yǎng)12 h后（排除血清干擾）［26］，加入不同濃度的IGF－1或MGF溶液（終濃度0、1、10、50、100、200ng／ml），于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2h后，按1.2.5所示測定巨噬細(xì)胞吞噬功能。每濃度3復(fù)孔，用不同的培養(yǎng)板重復(fù)3次。

表2 本研究熒光定量PCR引物一覽表Table 2 Primers Used for qRT－PCR

1.2.9 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，統(tǒng)計學(xué)顯著性水平定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 過度訓(xùn)練模型驗證

2.1.1 一般觀察

前8周運動組大鼠狀態(tài)變化不明顯，不需過多外力協(xié)助即能較好的完成訓(xùn)練。隨著每天訓(xùn)練頻次的增加，即從第9周開始至第11周，運動組大鼠精神狀態(tài)明顯下降，表現(xiàn)為毛發(fā)脫落、毛色晦暗、目光呆滯、易受驚嚇。同時，運動能力下降，跟不上既定速度，需多次用手驅(qū)趕，協(xié)助其完成規(guī)定時間的運動，運動后精疲力竭、喘息不止、趴地不起，且每天訓(xùn)練頻次越多，這一現(xiàn)象越明顯。

2.1.2 過度訓(xùn)練降低大鼠體重、血紅蛋白和睪酮含量

從表3可知，與安靜對照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠體重、血紅蛋白和睪酮含量均顯著降低，分別下降了約19.3%（P＜0.01）、13.5%（P＜0.01）和55.3%（P＜0.01）。

表3 本研究大鼠體重、血紅蛋白和睪酮含量變化一覽表Table 3 Body Weight，Hemoglobin，and Testosterone of Rats

2.2 過度訓(xùn)練抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能

過度訓(xùn)練組大鼠巨噬細(xì)胞攝取中性紅能力（0.27± 0.04）顯著低于安靜對照組（0.37±0.07），下降約27%，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 過度訓(xùn)練增加巨噬細(xì)胞IGF－1和MGF基因表達(dá)

熒光定量PCR分析顯示，過度訓(xùn)練組大鼠巨噬細(xì)胞IGF－1mRNA水平約為安靜對照組的21倍（P＜0.01）；MGF mRNA水平約為安靜對照組的92倍（P＜0.01）（圖1）。

圖1 過度訓(xùn)練對巨噬細(xì)胞IGF－1和MGF基因表達(dá)的影響示意圖Figure 1. Effect of Overtraining on IGF－1and MGF mRNA Level of Peritoneal Macrophages

2.4 MGF抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能

純化的巨噬細(xì)胞經(jīng)12h無血清培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞與不同濃度IGF－1孵育2h，結(jié)果表明，IGF－1對巨噬細(xì)胞吞噬功能沒有顯著影響，各濃度組與未加藥組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。而巨噬細(xì)胞與不同濃度的MGF孵育2 h，巨噬細(xì)胞攝取中性紅的能力顯著降低，且呈濃度依賴性，10ng／ml、50ng／ml組與未加藥組相比有顯著性差異（P＜0.05），100ng／ml、200ng／ml組與未加藥組相比有極顯著性差異（P＜0.01），各濃度組間比較無顯著性差異（P＞0.05）（圖2）。

3 討論

競技體育追求大強(qiáng)度的運動訓(xùn)練，運動員常處在過度訓(xùn)練的邊緣或已經(jīng)過度訓(xùn)練，這會對運動員運動成績的提高及身體健康造成嚴(yán)重影響，感染疾病的風(fēng)險也隨之增加［22］。本研究通過長時間、大強(qiáng)度運動模擬過度訓(xùn)練，觀察大鼠精神狀況及運動能力的變化，并監(jiān)測了反映過度訓(xùn)練的幾種常用指標(biāo)［1］。結(jié)果表明，在訓(xùn)練的后期，大鼠精神狀態(tài)及運動能力均降低。11周大強(qiáng)度運動使大鼠體重、血紅蛋白和睪酮含量均顯著降低（P＜0.01），與安靜對照組相比分別下降了約19.3%、13.5%和55.3%，表明11周大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)失衡狀態(tài)，過度訓(xùn)練模型得以建立。本研究發(fā)現(xiàn)，過度訓(xùn)練時，巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著低于安靜對照組大鼠，下降了約27%（P＜0.05）。吞噬功能作為巨噬細(xì)胞最為重要的功能之一，過度訓(xùn)練引起吞噬功能降低勢必抑制其清除病菌的能力，這可能是過度訓(xùn)練增加感染風(fēng)險的機(jī)制之一。

圖2 IGF－1和MGF對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響曲線圖Figure 2. Effect of IGF－1and MGF on the Phagocytosis of Peritoneal Macrophages

巨噬細(xì)胞能表達(dá)IGF－1，筆者推測，巨噬細(xì)胞也能表達(dá)IGF－1的異構(gòu)體MGF并受大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)。研究結(jié)果表明，11周大強(qiáng)度運動可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IGF－1和MGF基因表達(dá)急劇增加（分別增加約21倍和92倍）。巨噬細(xì)胞中MGF表達(dá)對運動應(yīng)激更敏感，這與肌肉中MGF表達(dá)對運動應(yīng)激更敏感的報道一致［12］。因 MGF具有不同于IGF－1的多種功能，其表達(dá)的差異可能具有重要生理意義。為探究過度訓(xùn)練狀態(tài)下巨噬細(xì)胞大量表達(dá)IGF－1和MGF的潛在意義，本研究采用離體方法觀察了不同濃度IGF－1或MGF對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各個濃度的IGF－1對巨噬細(xì)胞吞噬功能均無顯著影響，而MGF則呈濃度依賴性的抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能。這提示，巨噬細(xì)胞中MGF可通過自分泌或旁分泌形式對巨噬細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控。肌肉中MGF表達(dá)增加普遍被認(rèn)為是有益的，它可激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，參與運動性肌肉肥大、損傷肌肉修復(fù)和防止肌肉萎縮［11，18］。但本研究中MGF可呈濃度依賴性的抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能，表明MGF是巨噬細(xì)胞功能的負(fù)向調(diào)控因子。這些結(jié)果提示，過度訓(xùn)練時巨噬細(xì)胞中MGF呈高豐度表達(dá)具有重要生理意義，即MGF可能在抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究證明巨噬細(xì)胞可表達(dá)MGF且受大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)，且MGF參與了對巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)控，這可能是過度訓(xùn)練抑制免疫功能的新機(jī)制，但MGF抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能的具體信號途徑仍有待深入研究。

4 結(jié)論

過度訓(xùn)練抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能；過度訓(xùn)練誘導(dǎo)產(chǎn)生的MGF可能在過度訓(xùn)練抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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Overtraining Inhibiting Phagocytosis of Rat Peritoneal Macrophages：Role of IGF－1and MGF

XIAO Wei－h(huán)ua1，2，CHEN Pei－jie1

Objective：To investigate the effects of overtraining on the phagocytosis of peritoneal macrophages and the roles of IGF－1and MGF in this process.Methods：16male wistar rats were randomized to 2groups：sedentary group（n＝8）and overtraining group（n＝8）.Overtraining group was training in standard treadmill with an increasing load for 11weeks.36hafter the last session of exercise，record the body weight，blood was sampled at the retro－orbital sinus to determine the contents of hemoglobin and testosterone.Rats were sacrificed by decapitation，and then peritoneal macrophages were isolated and purified.The phagocytosis and mRNA levels of IGF－1and MGF were measured by the uptake of neutral red and real－time PCR respectively.In addition，we evaluate the effects of IGF－1and MGF peptide on phagocytosis of peritoneal macrophages in vitro（MФs were exposed to different concentrations of IGF－1or MGF peptide for 2h）.Results：There was a decline of body weight（by 19.3%），hemoglobin（by 13.5%）and testosterone（by 55.3%）in overtraining group when compared with control group（P＜0.01）.Overtraining significantly inhibited phagocytosis of MФs（declined by 27%，P＜0.05）.When compared with the control group，IGF－1and MGF mRNA level in MФs from overtraining group increased 21－fold and 92fold，respectively（P＜0.01）.In vitro experiments showed that IGF－1had no significant effects on phagocytosis of MФs，there were no significant difference in each concentration when compared with untreated cells（P＞0.05）.Unlike IGF－1，MGF peptide impaired the phagocytosis of MФs in dose－independent manner.There were signifcant differences in 10ng／ml（P＜0.05），50ng／ml（P＜0.05），100ng／ml（P＜0.01），200ng／ml（P＜0.01），when compared with the untreated cells.There were no significant difference between different concentrations of MGF（P＞0.05）.Conclusion：These results suggest that overtraining inhibits the phagocytosis of peritoneal macrophages，and MGF produced by macrophages may play a key role in this process.

overtraining；macrophages；phagocytosis；insulin－likegrowthfactor－1；mecha－nogrowthfactor；rat；animalexperiment

G804.7

A

2011－07－06；

2011－09－11

國家自然科學(xué)基金資助項目（30971422）；上海市重點學(xué)科建設(shè)資助項目（S30802）；上海體育學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（yjscx201004）。

肖衛(wèi)華（1981－），男，湖南安化人，講師，在讀博士研究生，研究方向為運動與健康促進(jìn)，Tel：（021）51253242，E－mail：xiaoweihua1115＠163.com；陳佩杰（1962－），男，浙江舟山人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向為運動免疫學(xué)與青少年體質(zhì)研究，Tel：（021）51253626，E－mail：chengpjk＠online.sh.cn。

1.上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院，上海200438；2.湘南學(xué)院體育系，湖南郴州423000

1.College of Exercise and Sport Science，Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China；2.Department of Physical Education，Xiangnan University，Chenzhou 423000，China.

1000－677X（2011）10－0067－05