賀 強(qiáng)，張 纓

耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)AMPKα2對(duì)鼠骨骼肌pp38和P－MEF2的影響

賀 強(qiáng)，張 纓

目的：研究耐力性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPKα2 3種不同基因型鼠骨骼肌p38、pp38和PMEF2A蛋白表達(dá)的影響，以探討運(yùn)動(dòng)激活MEF2的具體機(jī)制。方法：AMPKα2 3種不同基因型鼠各20只，分別分成安靜對(duì)照組和耐力訓(xùn)練組，每組10只。安靜組小鼠不施加任何運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，耐力訓(xùn)練組小鼠進(jìn)行速度為12m／min，每天1h，每周6天，持續(xù)4周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。Western blot法測(cè)定骨骼肌p38、pp38和核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)。結(jié)果：1）4周耐力訓(xùn)練后，AMPKα2 3種基因型鼠pp38蛋白表達(dá)均顯著提高，并且AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，p38和pp38蛋白表達(dá)明顯增加，而AMPKα2敲除鼠pp38表達(dá)雖然低于野生鼠，但沒(méi)有顯著性差異；2）耐力訓(xùn)練組與安靜組相比，AMPKα2 3種基因型鼠骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)均顯著增加，并且AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，核內(nèi)P－MEF2A表達(dá)顯著增加，而AMPKα2敲除鼠P－MEF2A與野生鼠相比沒(méi)有顯著性差異；3）42只小鼠骨骼肌內(nèi)pp38與核內(nèi)P－MEF2A表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（R＝0.69，P＜0.05）。結(jié)論：4周耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2 3種不同基因型鼠骨骼肌內(nèi)p38蛋白表達(dá)影響不大，但可以顯著促進(jìn)p38和MEF2A的激活。AMPKα2可能不是惟一激活p38和MEF2A的途徑，耐力訓(xùn)練可能通過(guò)pp38激活MEF2A。

腺苷酸活化蛋白激酶α2；絲裂原活化蛋白激酶p38；肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A；耐力訓(xùn)練；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

糖代謝是物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)，骨骼肌是體內(nèi)最主要攝取葡萄糖和代謝葡萄糖的組織之一。葡萄糖運(yùn)載體4（glucose transporter 4，GLUT4）介導(dǎo)的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是骨骼肌糖代謝的主要限速步驟。研究顯示，GLUT4的表達(dá)從根本上決定了其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力，其表達(dá)失常是胰島素抵抗的重要因素［10］。研究表明，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（myocyte enhancer factor 2）是GLUT4轉(zhuǎn)錄過(guò)程的必需因子，其中，MEF2A是此過(guò)程中發(fā)揮生理作用的主要亞型。另外，已有研究報(bào)道，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）亞家族成員－p38MAPK在其磷酸化pp38形式下，可通過(guò)與MEF2結(jié)合促進(jìn)MEF2磷酸化，從而增強(qiáng)MEF2轉(zhuǎn)錄活性［20，35］。

本實(shí)驗(yàn)室前期的工作已表明，以AMPKα2 3種基因型小鼠為研究對(duì)象，4周耐力運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)AMPKα2促進(jìn)骨骼肌MEF2對(duì)GLUT4的轉(zhuǎn)錄活性以及GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)［15］，然而，AMPK調(diào)節(jié)MEF2的具體機(jī)制尚不明了。因此，本文試圖仍以AMPKα2 3種基因型小鼠為研究對(duì)象，研究4周耐力性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌p38、pp38和核內(nèi)P－MEF2A表達(dá)的影響以及pp38和P－MEF2A的關(guān)系，以進(jìn)一步探討耐力運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)AMPKα2提高M(jìn)EF2對(duì)GLUT4轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

健康2月齡的C57BL／6J野生（Wild－type，WT）小鼠、AMPKα2轉(zhuǎn)基因（Over－expressing，OE）小鼠和AMPKα2基因敲除（Knockout，KO）小鼠各20只，體重18±2g。其中，AMPKα2轉(zhuǎn)基因小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所建立、繁殖提供。AMPKα2基因敲除小鼠由Department of Endocrinology，Metabolism and Cancer Institute，Cochin University，Paris Descartes，F(xiàn)rance提供2只，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所代為保種繁殖。北京體育大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)房溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，每天光照12h，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

AMPKα2 3種不同基因型小鼠經(jīng)過(guò)為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，并進(jìn)行1～2次適應(yīng)性跑臺(tái)練習(xí)后，分別按照體重隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（control，C）和耐力訓(xùn)練組（endurance training，T），共6組，每組10只（表1）。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)分組一覽表Table 1 Experiment Groups

1.2 運(yùn)動(dòng)方案設(shè)計(jì)和取材

安靜對(duì)照組不施加任何運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，安靜狀態(tài)下籠養(yǎng)。耐力訓(xùn)練組小鼠運(yùn)動(dòng)方式采取0坡度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑臺(tái)速度為12m／min（約75%˙VO2max強(qiáng)度），運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型參照Fernado方案［11］，每天訓(xùn)練1h，每周6天，共持續(xù)4周。

訓(xùn)練組小鼠最后一次訓(xùn)練后禁食，12h后采取頸椎脫臼法處死小鼠，取雙側(cè)股四頭肌，冰水中除去可見(jiàn)血液、脂肪、筋膜，用錫紙包裹并標(biāo)記，迅速置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑及儀器

超低溫冰箱（Thermo），HANNA酸度計(jì)，低溫高速離心機(jī)，生物電泳圖像分析軟件（FR－980Smart View復(fù)日科技），電動(dòng)勻漿器，電泳儀（DYY－11型，北京六一儀器廠），搖床（TS－1ORBITAL SHAKER），Sartorius精密電子天平。

蛋白酶抑制劑Cocktail試劑盒（SIGMA），X光片（Kodak），發(fā)光液（ECL Western Blotting Substrate，Pierce），PageRulerTMPrestained Protein Ladder（Fermentas），一抗［Phospho－p38MAPK（Thr180／Tyr 182），Mouse mAb，Cell Signaling Technology；p38α／β（H－147），rabbit polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology；Phospho－MEF2A（Thr312），rabbit polyclonal IgG，Abcam］；二抗（Goat Anti－rabbit IgG，HRP－linked Antibody，Cell Signaling Technology；Goat Anti－mouse IgG，HRP－linked Antibody，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）和內(nèi)參（β－actin，rabbit polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology）。

1.4 指標(biāo)測(cè)試方法

1.4.1 總蛋白的提取

總蛋白提取方法為：將約40mg股四頭肌樣品置于400μl蛋白裂解液中（50mM Tris－Cl pH7.4～8.0，150 mM NaCl，5mM EDTA，1%Tritor x－100，4μl 100×蛋白酶抑制劑混合物），在4℃下用電動(dòng)勻漿機(jī)充分勻漿，在低溫高速離心機(jī)（4℃）內(nèi)14 000rpm離心50min，取上清液至－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 核蛋白提取

P－MEF2A采用Pierce核蛋白提取試劑盒，取約40mg股四頭肌置于400μl CER1（CRE：蛋白酶抑制劑＝100∶1）溶液中，在4℃下用電動(dòng)勻漿機(jī)充分勻漿，振蕩器高速震蕩5s，靜置約10min，加入22μlCER2溶液，振蕩器最高速震蕩5s，冰上靜置10min，低溫高速離心機(jī)16 000rpm離心約10min，棄上清液，向沉淀物中加入200μl NER溶液，冰上靜置10min，震蕩混勻，重復(fù)3～4次，最后低溫離心機(jī)16 000rpm 10min，取上清液即核蛋白，于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 Western Blot

蛋白濃度的測(cè)定，采用Pierce公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量試劑盒，試劑配制如表2所示。待測(cè)樣品稀釋5倍（2.5μl蛋白樣品＋22.5μl PBS溶液），BCA工作液為BCA試劑A和BCA試劑B按照50∶1的比例配制而成的藍(lán)色溶液。待測(cè)樣品孔為200μlBSA工作液＋25μl稀釋過(guò)的待測(cè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)孔為200μlBSA工作液＋25μl不同濃度梯度的牛血清蛋白反應(yīng)試劑。樣品OD值由酶標(biāo)儀 ，并由聯(lián)機(jī)軟件繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線［2］（圖1）。

表2 本研究蛋白濃度測(cè)定試劑配制一覽表Table 2 Preparation of Diluted Albumin（BSA）Standards

圖1 蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 1. Standard Curve forDetermining the Protein Concentration

得出蛋白濃度后，會(huì)根據(jù)蛋白濃度計(jì)算蛋白上樣量，并制備上樣用的蛋白（變性）。分別采用12%（p38、pp38）和10%（P－MEF2A）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出目的蛋白和內(nèi)參蛋白（β－actin），再轉(zhuǎn)至0.45μm硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉液中室溫下置于搖床上封閉1h，一抗4℃過(guò)夜（p38：1∶1 000，TBST稀釋；β－actin：1∶1 000， TBST稀釋；pp38：1∶1 000，TBST稀釋；β－actin：1∶1 000，TBST稀釋；P－MEF2A：1∶1 500，TBST稀釋；β－actin：1∶1 000，TBST稀釋）。次日，1×TBST洗劑3次，每次10 min，最后1×TBS洗劑1次，8min。二抗孵育（p38：1∶10 000，TBST稀釋；β－actin：1∶4 000，TBST稀釋；pp38：1∶2 000，5%脫脂牛奶稀釋；β－actin：1∶2 000，TBST稀釋；P－MEF2A：1∶2 000，5%脫脂牛奶稀釋；β－actin：1∶6 000，TBST稀釋），室溫下置于搖床輕搖1h；1×TBST洗滌3次，最后1×TBS洗滌1次，每次10min。將NC膜置于發(fā)光液中反應(yīng)約1min，X光片暗室曝光、顯影、定影。用生物電泳圖像分析軟件對(duì)曝光所得片子進(jìn)行拍照，使用Image J軟件讀取目的蛋白和內(nèi)參蛋白蛋白條帶的積分灰度值，結(jié)果用目的蛋白積分灰度值與內(nèi)參積分灰度值的比值表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 骨骼肌p38蛋白表達(dá)

圖2 AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌p38MAPK蛋白表達(dá)電泳圖譜Figure 2. Representative Immunoblots of p38MAPK in Various Groups

圖3 AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌p38蛋白表達(dá)的變化示意圖Figure 3. p38MAPK Protein Expression in Various Groups

由圖2、圖3可以看出，在耐力訓(xùn)練后，小鼠骨骼肌p38表達(dá)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，對(duì)照組p38表達(dá)無(wú)顯著性差異，而耐力訓(xùn)練后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠p38表達(dá)顯著高于野生鼠。AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌內(nèi)p38表達(dá)無(wú)論安靜時(shí)還是運(yùn)動(dòng)后始終低于野生鼠，但沒(méi)有顯著性差異，與AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠相比，無(wú)論安靜狀態(tài)下還是耐力運(yùn)動(dòng)后p38表達(dá)均低于AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠，且運(yùn)動(dòng)后具有顯著性差異。

2.2 骨骼肌pp38蛋白表達(dá)

圖4 AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌pp38蛋白表達(dá)電泳圖譜Figure 4. Representative Immunoblots of pp38MAPK in Various Groups

圖5 AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌pp38蛋白表達(dá)的變化示意圖Figure 5. pp38Phosphorylation（P）Activity in Various Groups

由圖4、圖5可知，AMPKα2 3種基因型鼠在耐力訓(xùn)練后，與對(duì)照組相比，骨骼肌內(nèi)pp38均顯著上升，具有非常顯著性差異。AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠pp38表達(dá)，安靜狀態(tài)下與野生鼠相比沒(méi)有顯著性差異，但耐力訓(xùn)練后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠pp38顯著高于野生鼠。AMPKα2基因敲除鼠pp38表達(dá)始終低于野生鼠，但沒(méi)有顯著性差異。

2.3 骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)

從圖6、圖7可以得知，AMPKα2 3種基因型鼠4周耐力訓(xùn)練后，骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A與對(duì)照組相比均具有非常顯著性差異（P＜0.01）。AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，安靜狀態(tài)下P－MEF2A無(wú)顯著性差異，但是耐力運(yùn)動(dòng)后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠P－MEF2A增加顯著高于野生鼠。AMPKα2基因敲除鼠P－MEF2A無(wú)論安靜時(shí)還是運(yùn)動(dòng)后始終低于野生鼠，沒(méi)有顯著性差異。

2.4 耐力訓(xùn)練前、后AMPKα2 3種基因型鼠pp38與PMEF2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

由圖8可知，無(wú)論是安靜狀態(tài)下還是4周耐力訓(xùn)練后，pp38和P－MEF2A在小鼠骨骼肌內(nèi)表達(dá)含量變化均呈一致，呈非常顯著性正相關(guān)。

3 討論

3.1 耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌內(nèi)p38和pp38蛋白表達(dá)的影響

p38MAPK主要表達(dá)4個(gè)亞型：p38α、p38β、p38γ和p38δ，這些亞型可以通過(guò)蘇氨酸－甘氨酸－酪氨酸（TGY）雙位點(diǎn)磷酸化模塊來(lái)分類。其中，p38α和p38β廣泛表達(dá)于各種組織中，p38δmRNA主要發(fā)現(xiàn)于肺、腎臟中［18］，p38γ則幾乎只在骨骼肌中表達(dá)［22］。

圖6 AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)電泳圖譜Figure 6. Representative Immunoblots of P－MEF2Ain Various Groups

圖7 AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A含量的變化示意圖Figure 7. MEF2APhosphorylation（P）Activity in Various Groups

圖8 耐力訓(xùn)練前、后AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌pp38與核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性散點(diǎn)圖（R＝0.69，n＝42；P＜0.01）Figure 8. Correlations between pp38and P－MEF2AProtein Expression in Various Groups before and after Endurance Training

運(yùn)動(dòng)可以產(chǎn)生多種信號(hào)來(lái)刺激機(jī)體，使機(jī)體的各種信號(hào)通路產(chǎn)生適應(yīng)性的變化，p38MAPK也不例外。1996年Goodyear等［14］首次報(bào)道，p38在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠骨骼肌中被激活，從此運(yùn)動(dòng)和肌肉收縮對(duì)p38蛋白表達(dá)的研究引起了廣大研究者的興趣。研究顯示，受試者馬拉松跑后，股外側(cè)肌活檢發(fā)現(xiàn)pp38顯著增加了，但是p38蛋白的表達(dá)卻沒(méi)有改變［34］。據(jù)報(bào)道，急性運(yùn)動(dòng)一般不會(huì)影響p38蛋白的表達(dá)含量［32］，但是，長(zhǎng)時(shí)間耐力性運(yùn)動(dòng)對(duì)p38表達(dá)的影響的研究報(bào)道則是有差異的。Ginneken［31］等報(bào)道稱，4周游泳訓(xùn)練后p38蛋白表達(dá)含量沒(méi)有顯著變化。曹師承等［1］報(bào)道，兩組大鼠分別以1h／次／d和1.5h／次／d進(jìn)行7周的游泳訓(xùn)練后，發(fā)現(xiàn)1h組大鼠骨骼肌內(nèi)p38含量不變，而1.5h組大鼠骨骼肌內(nèi)p38反而下調(diào)，推測(cè)可能是訓(xùn)練量過(guò)大造成了p38蛋白的分解。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMPKα2 3種基因型鼠在4周耐力訓(xùn)練后，骨骼肌p38蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異；AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，對(duì)照組無(wú)顯著性差異，但耐力訓(xùn)練后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨p38表達(dá)顯著高于野生鼠；AMPKα2基因敲除鼠p38蛋白表達(dá)無(wú)論安靜時(shí)還是運(yùn)動(dòng)后始終低于野生鼠，但沒(méi)有顯著性差異。由此可見(jiàn)，僅4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練＋AMPKα2基因的高表達(dá)可促進(jìn)p38蛋白表達(dá)的顯著增加，其原因仍有待于進(jìn)一步探討。

大量研究表明，一次性運(yùn)動(dòng)或者耐力性運(yùn)動(dòng)都會(huì)顯著激活p38，使其變成pp38，pp38進(jìn)一步的活化其下游分子，如PGC1［28，20，4］、MEF2［35，8］等。McGee［24］等發(fā)現(xiàn)，受試者以70%˙VO2max進(jìn)行60min的蹬自行車(chē)運(yùn)動(dòng)后，p38蛋白的活性提高了4.8倍（P＜0.05），核內(nèi)p38蛋白的活性也提高了1.8倍（P＜0.05）。本研究顯示，AMPKα2 3種基因型鼠4周耐力訓(xùn)練后，與對(duì)照組相比，pp38含量平均顯著上升，具有非常顯著性差異（P＜0.01），分別是對(duì)照組的1.7倍、1.7倍和1.8倍，研究結(jié)果與前人結(jié)果相吻合。AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠pp38表達(dá)，在安靜狀態(tài)下與野生鼠相比較沒(méi)有顯著性差異，但是耐力訓(xùn)練后AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠pp38表達(dá)顯著高于野生鼠，提示了AMPKα2參與了激活p38MAPK信號(hào)通路，研究結(jié)果與前人基本一致。雖然AMPKα2基因敲除鼠與野生鼠pp38表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，但這足以提示，此運(yùn)動(dòng)方式下AMPKα2基因的高表達(dá)影響了p38的激活。當(dāng)然，AMPKα2基因敲除鼠pp38表達(dá)與野生鼠相比沒(méi)有顯著性差異，也提示AMPKα2可能不是惟一激活p38的信號(hào)分子，也許運(yùn)動(dòng)募集其他信號(hào)通路或者AMPK亞型參與激活p38。有報(bào)道稱，低到中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)（＜70%˙VO2max，peak）可以引起適度訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)對(duì)象AMPKα2特異性和強(qiáng)度依賴性的增多，而AMPKα1活動(dòng)沒(méi)有變化。這可能與AMPK復(fù)合體含有的AMPKα2對(duì)AMP有更大的依賴性，而不是AMPKα1有關(guān)［13］。Jorgensen［19］2007年的研究表明，大鼠骨骼肌在運(yùn)動(dòng)或者收縮后AMPKα1和α2都會(huì)激活，而在人體骨骼肌中α2亞單位對(duì)運(yùn)動(dòng)更敏感，但在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)是否α2亞單位對(duì)運(yùn)動(dòng)更敏感有待研究。

3.2 耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)的影響

MEF2廣泛存在于肌肉細(xì)胞中，是最早被稱為具有肌肉特性的DNA結(jié)合活性的因子，可與大部分肌肉特定基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子直接結(jié)合［27］。脊椎動(dòng)物擁有4種MEF2亞型，分別是MEF2A／B／C／D［6］，其中，骨骼肌主要表達(dá)MEF2A／C／D［12］。目前發(fā)現(xiàn)，MEF2最突出的功能是控制肌肉的生成與分化，介導(dǎo)骨骼肌、心肌和平滑肌發(fā)育過(guò)程中肌細(xì)胞的分化［6，21，7］，MEF2在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化中也發(fā)揮重要生理作用［23，25，26］；研究還發(fā)現(xiàn)，MEF2是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［3］。此外，還有研究表明，MEF2可能參與了T細(xì)胞增殖、分化［5］、骨的發(fā)育［33］等。

研究證實(shí)，MEF2是GLUT4蛋白轉(zhuǎn)錄過(guò)程的必需因子，它可以和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合共同調(diào)節(jié)GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄［17］。MEF2A主要以MEF2A／D二聚體的形式存在［21］，這對(duì)于GLUT4的表達(dá)是必需的［30］。很多轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)都是由其磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)的［6］，MEF2被激活后可以顯著地提高其轉(zhuǎn)錄活性，從而提高GLUT4的表達(dá)。研究已經(jīng)表明，在體的肌肉收縮能夠激活骨骼肌中的MEF2，P－MEF2能夠顯著提高M(jìn)EF2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄［35］，提高M(jìn)EF2與靶基因結(jié)合的能力，從而可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)GLUT4基因的表達(dá)，使得機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力增加。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電刺激肌肉收縮MEF2A含量增加［9］，但增加的具體原因尚不清楚。McGee等讓受試者進(jìn)行蹬自行車(chē)運(yùn)動(dòng)，采用特定的識(shí)別MEF2磷酸化位點(diǎn)的抗體發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后MEF2蘇氨酸－脯氨酸磷酸化水平提高了2.7倍（P＜0.05）［24］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MEF2的DNA結(jié)合活性提高了1.6倍。Yu等在2001年對(duì)11名經(jīng)過(guò)馬拉松測(cè)試的健康成年男子采用電泳遷移率變動(dòng)分析法（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）分析發(fā)現(xiàn)，MEF2的DNA結(jié)合活性明顯增加，約為運(yùn)動(dòng)前的1.7倍［9］。

本研究顯示，AMPKα2 3種不同基因型鼠4周耐力訓(xùn)練后，骨骼肌細(xì)胞核P－MEF2A含量與對(duì)照組相比均具有非常顯著性差異（P＜0.01）。AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，耐力訓(xùn)練后P－MEF2A含量顯著增加（P＜0.05）。AMPKα2基因敲除鼠與野生鼠相比，P－MEF2A含量在安靜狀態(tài)下和耐力訓(xùn)練后均無(wú)顯著性差異。這一結(jié)果提示，在此運(yùn)動(dòng)方式下，AMPKα2的高表達(dá)促進(jìn)了MEF2A的激活，增加了P－MEF2A的表達(dá)，并可能存在其他并行信號(hào)通路或者其他AMPK亞型激活了MEF2A，從而可代償AMPKα2基因缺失的影響。

3.3 耐力訓(xùn)練前、后AMPKα2 3種基因型小鼠骨骼肌pp38與核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

關(guān)于MEF2激活的機(jī)制，目前研究多有分歧。MEF2與鈣依賴性信號(hào)通路密切相關(guān)，運(yùn)動(dòng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋濃度提高，可以通過(guò)p38、活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）或者蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等通路增強(qiáng)MEF2的轉(zhuǎn)錄活性［6，29，3］。前人研究報(bào)道稱，p38在運(yùn)動(dòng)后被激活，pp38可以與MEF2結(jié)合直接活化MEF2，從而提高P－MEF2的表達(dá)，進(jìn)而提高GLUT4 mRNA表達(dá)［24］。其中令人遺憾的是，由于樣本量的限制，本研究沒(méi)有進(jìn)一步的測(cè)定pp38－MEF2的結(jié)合，從而確定pp38對(duì)MEF2的作用。但本實(shí)驗(yàn)將安靜狀態(tài)和4周耐力訓(xùn)練后pp38和P－MEF2A進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，pp38和P－MEF2A呈密切正相關(guān)R＝0.69，P＜0.01。這就提示，MEF2A的激活與pp38密不可分。

4 結(jié)論

1.4周耐力訓(xùn)練與安靜對(duì)照相比，AMPKα2 3種基因型鼠骨骼肌pp38蛋白表達(dá)均顯著提高，并且，AMPKα2轉(zhuǎn)基因小鼠與野生鼠相比，骨骼肌p38和pp38蛋白表達(dá)也明顯增加。AMPKα2基因敲除小鼠pp38蛋白表達(dá)雖然低于野生鼠，但沒(méi)有顯著性差異。提示，可能存在著“運(yùn)動(dòng)－AMPKα2－p38激活”通路，但AMPKα2可能不是激活p38的惟一信號(hào)分子，運(yùn)動(dòng)可募集AMPKα2外其他信號(hào)通路激活p38。

2.4周耐力訓(xùn)練與安靜對(duì)照相比，AMPKα2 3種基因型鼠骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)均顯著增加，并且，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比，骨骼肌核內(nèi)P－MEF2A蛋白表達(dá)顯著增加，而AMPKα2基因敲除鼠P－MEF2A與野生鼠相比沒(méi)有顯著性差異。提示，可能存在著“運(yùn)動(dòng)－AMPKα2－MEF2A激活”通路，但AMPKα2可能不是激活MEF2A的惟一信號(hào)分子。

3.4周耐力訓(xùn)練前、后，AMPKα2 3種基因型鼠骨骼肌pp38與P－MEF2A蛋白表達(dá)量顯著相關(guān)，表明4周耐力訓(xùn)練可能通過(guò)pp38激活MEF2A。

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Effects of Endurance Training Inducing AMPKα2 on the Protein Expression of pp38 and P－MEF2in Skeletal Muscle of Mice

HE Qiang，ZHANG Ying

Objective：The role of AMPKα2in regulating endurance treadmill exercise induced p38，pp38and P－MEF2Awas investigated to explore the explicit mechanism of activation of MEF2by exercise.Methods：Wild－type（WT，n＝20），AMPKα2transgenic（TG，n＝20）and AMPKα2knockout（KO，n＝20）mice were randomly divided into control group and endurance exercise group by the weight.The control group had not been exerted any exercise load while the exercise group had undertaken one－h(huán)our／day treadmill exercise with an intensity of 12m／min for 6days／week with a duration of four weeks.p38，pp38and P－MEF2Aprotein expressions were measured by Western Blot.Results：1）The overall pp38protein expression of the three types AMPKα2mice after four－week endurance training significantly increased.In addition，the p38and pp38protein expression of AMPKα2transgenic mice increased obviously compared to the wild－type mice.Although the pp38protein expression of AMPKα2knockout mice is lower than the wild－type mice，there is no significant difference at all.2）After four week endurance training，P－MEF2Acontent in the nucleus of skeletal muscle cell among the three kinds of AMPKα2mice increase significantly compared to the control group and the nucleus P－MEF2Aexpression of AMPKα2transgenic mice was significantly higher than the wild－type mice while there was no significant difference between the AMPKα2knockout mice and the wild－type mice.3）The phosphorylation activity of p38and MEF2Ain the skeletal muscle of 42mice are highly positive correlated（R＝0.69，P＜0.05）.Conclusion：The influence on the expression of p38protein caused by endurance training for the three types’mice is not significant.However，endurance training can greatly promote the phosphorylation activity of p38and MEF2A.The data also suggests that perhaps AMPKα2is not the only pathway to activate p38as well as MEF2A.The phosphorylation activity of p38is closely related to the phosphorylation of MEF2A.

AMPKα2；p38MAPK；MEF2A；endurancetraining；rat；animalexperiment

G804.7

A

2011－08－20；

2011－09－20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30971412）；北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（5102024）。

賀強(qiáng)（1987－），男，山東日照人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué)，E－mail：heqiang224＠163.com；張纓（1961－），女，北京人，教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和骨骼肌代謝適應(yīng)，Tel：（010）62989584，E－mail：zhyi9256＠126.com。

北京體育大學(xué)，北京100084

Beijing Sport University，Beijing 100084，China.

1000－677X（2011）10－0072－07

book=73,ebook=308