曾文利

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ外科 湖北 430060)

Cyclin D1在膀胱癌中的表達(dá)及意義

曾文利

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ外科 湖北 430060)

目的 探討細(xì)胞因子CyclinD1在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2000-2006年有完整臨床和病理資料的膀胱癌存檔蠟塊50例和5例癌旁組織,采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測50例膀胱癌和5例癌旁組織中CyclinD1的表達(dá)水平,分析了CyclinD1與臨床分期,病理分級的關(guān)系。采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng),對CyclinD1的表達(dá)進(jìn)行定量分析,并用SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗(yàn)。結(jié)果 CyclinD1在膀胱癌中呈高表達(dá),癌旁組織中呈低表達(dá),差異有顯著性 (P<0.05)。圖像分析結(jié)果顯示:膀胱癌與癌旁組織之間,CyclinD1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異(P<0.05),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,CyclinD1表達(dá)與膀胱癌病理分級臨床分期無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 CyclinD1在膀胱癌中的異常表達(dá)可能參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

膀胱癌; CyclinD1; 免疫組織化學(xué)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,其發(fā)生率在男性腫瘤中已上升至第4位,在女性腫瘤中居第8位,其主要的病理類型是膀胱癌,約占90%以上[1]。STA T3是近年來研究異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖和凋亡,又被稱為癌基因[2]。CyclinD1是STA T3的一個(gè)下游靶基因,其作為細(xì)胞周期核因子,可使細(xì)胞由 G1期向S期轉(zhuǎn)變促進(jìn)細(xì)胞增殖,是STA T3信號通路中的關(guān)鍵因子。本研究通過檢測CyclinD1在膀胱癌的表達(dá),探討CyclinD1與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及臨床、病理的關(guān)系,以提高人們對膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及膀胱癌生物學(xué)行為的認(rèn)識。探討其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中所起的作用。

材料和方法

1.材料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2004-2006年病理學(xué)證實(shí)的膀胱癌病例50例,其中男性38例,女性12例,平均年齡50.3歲,另取5例癌旁組織做對照。標(biāo)本均經(jīng)HE染色,光鏡觀察診斷,按WHO病理分級標(biāo)準(zhǔn),G1 30例,G2 15例,G3 5例;按UICC臨床分期,淺表性腫瘤(Tis-T1)31例,浸潤性腫瘤(T2-T4)19例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例,化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。膀胱腫瘤病理分級與臨床分期見表1。

2方法

2.1 HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

2.2 主要試劑 即用型兔抗人CyclinD1多克隆抗體;(北京中杉生物技術(shù)有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒;(北京中杉生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試盒及多聚賴氨酸 (北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

表1 膀胱腫瘤病理分級與臨床分期Table 1 Bladder tumor Pathological grade and clinical stage

2.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測CyclinD1相關(guān)抗原:5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后,行檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù),滴加3%過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性,正常羊血清濕盒孵育減少非特異性背景;滴加一抗,4℃孵育過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗,37℃濕盒孵育10min;DAB顯色,光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間;蘇木素復(fù)染;分色、返藍(lán)、脫水、透明,中性樹膠封片并鏡檢;用 PBS代替一抗作為陰性對照組,購買的陽性片作為CyclinD1的陽性對照組。

3結(jié)果判斷

3.1 CyclinD1以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng),陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外,應(yīng)無棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物。

3.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像公司)對CyclinD1的表達(dá)進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400),測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。(陽性面積率=單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%)

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.CyclinD1的表達(dá)

癌旁組織細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒,CyclinD1表達(dá)弱(圖1a);膀胱癌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒,CyclinD1呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1b)。圖像分析結(jié)果顯示:膀胱移行細(xì)胞癌的平均光密度為0.9851±0.0084;癌旁組織的平均光密度為0.2637±0.0037。膀胱癌的陽性面積率為 1.0658±0.0075;癌旁組織的陽性面積率為 0.2980±0.0046。經(jīng)q檢驗(yàn),膀胱癌與癌旁組織之間,CyclinD1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異(P<0.05)(表 1)。

表1 膀胱癌和癌旁組織Cyclin D1表達(dá)的平均光密度和陽性面積率(ˉx±s)Table 1 The average optical density and the rate of positive area of Cyclin D1 in transitional cell carcinoma of bladder and cancer side tissue(ˉx ±s)

2.CyclinD1在不同分化腫瘤中表達(dá)的比較(表2)。

CyclinDI在分化較好的腫瘤中表達(dá)高于分化差的腫瘤,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P>0.05差異不顯著。

表2 CyclinD1在不同分化腫瘤中表達(dá)的比較Table 2 CyclinD1 expressed in different tumor differentiation comparison

圖1 a.CyclinD1表達(dá)弱(SP×200);b.膀胱癌CyclinD1的表達(dá),膀胱癌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒,CyclinD1呈強(qiáng)陽性表達(dá)(SP×200)Fig.1 a.the expression of CyclinD1 in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm,which showed expressed weakly.S-P×200;b.the expression of CyclinD1 in transitional cell carcinoma of bladder.There were plenty of brown particles in the nuclear,which showed CyclinD1 expressed strongly(S-P×200)

討 論

CyclinD1是 G1/S期過渡檢查點(diǎn)的重要調(diào)控因子,通過刺激細(xì)胞周期素依賴性激酶4(cyclinD-dependent Kinase4,CDK4)介導(dǎo) Rb基因蛋白產(chǎn)物的磷酸化,從而解除Rb對轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制效應(yīng),游離的 E2F進(jìn)入核內(nèi)結(jié)合一系列具有特殊序列的基因啟動(dòng)區(qū),促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞將通過 G1→S調(diào)控點(diǎn),進(jìn)入自主分裂程序[3,4]。因此,cyclinD1的表達(dá)上調(diào)使細(xì)胞失控性生長。

cyclinD1是促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行的重要調(diào)節(jié)因子,許多腫瘤存在它們的表達(dá)異常。

細(xì)胞在生長因子外源性有絲分裂原的刺激下,CyclinD1mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加,到 Gl期中部達(dá)高峰,Cyclin E在CyclinD1高峰后開始表達(dá)增加,于 G,/S轉(zhuǎn)折點(diǎn)處達(dá)峰值。CyclinD1、Cyclin E分別與CDK4、6和CD凡結(jié)合形成復(fù)合物發(fā)揮作用。CyclinD1過度表達(dá),使細(xì)胞周期 Gl/s轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程和細(xì)胞過度增殖,導(dǎo)致細(xì)胞癌變。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CyclinD1作為原癌基因,促增殖作用的細(xì)胞周期素,在分化較好增殖較少的高分化腫瘤中表達(dá)更多。以往研究表明,表達(dá)野生型PRb的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞和G1進(jìn)展都需要有CyclinD1,而 PRb失活的細(xì)胞株中CyclinD1蛋白和mRNA水平都很低下,其功能也不為細(xì)胞周期進(jìn)展所需要。也許正是由于Rb的表達(dá)缺少造成了高分級膀胱癌中CyclinD1的低表達(dá)率。高分級膀胱癌中活躍的細(xì)胞增殖可能還存在除CyclinD1之外的調(diào)控機(jī)制。CyclinD1過表達(dá)在膀胱癌組與癌旁組織比較差異顯著,與臨床分期無關(guān)。由此推測,CyclinD1過表達(dá)可能是膀胱癌發(fā)生過程的早期事件,CyclinD1可能是在以細(xì)胞增殖為必要步驟的始發(fā)階段發(fā)揮作用,不參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移過程。

多項(xiàng)研究表明,cyclinD1為stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因。Amin等[5]在淋巴瘤細(xì)胞中選擇性抑制stat3活性可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期的延長。Leslie等[6]研究證明stat3是通過其SH2結(jié)構(gòu)域與v-Src結(jié)合,上調(diào)cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá),加快細(xì)胞增殖,介導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。STA T3作為一種關(guān)鍵性的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,主要通過酪氨酸磷酸化作用成為磷酸化STA T3單體,并形成二聚體轉(zhuǎn)移入核,調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,在前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌等惡性腫瘤組織和細(xì)胞株中存在異常表達(dá)和活性增強(qiáng),提示STA T3在癌腫發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[7,8]。本研究的結(jié)果也表明,CyclinD1在膀胱癌中呈高表達(dá),癌旁組織中呈低表達(dá),差異有顯著性 (P<0.05)。這些結(jié)果提示:cyclinD1在膀胱癌中異常高表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞周期循環(huán)加速和細(xì)胞持續(xù)異常增殖,推測cyclinD1在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中起了一定的作用。

腫瘤的治療中,一個(gè)非常重要的問題是如何判斷腫瘤的生物學(xué)特性。目前還沒有合適的生物學(xué)指標(biāo)可以準(zhǔn)確的預(yù)測膀胱癌的發(fā)展和預(yù)后。cyclinD1在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用,有可能成為判斷膀胱癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。

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Expression of Cyclin D1 in bladder carcinoma and its signif icance

Zeng Wenli
(Department of Urology,Renmin Hospital of Wuhan university,Hubei 430060,china)

Objective To investigate the expression of CyclinD1 in bladder carcinoma and its clinical significance.Methods The paraffin blocks of 50 cases of bladder transitional cell carcinoma and 5 cases of adjacent tissues with a complete clinical and pathological data were collected f rom the department of pathology in Renmin Hospital of Wuhan University between 2000 and 2006.Immunohistochemical SP method was performed to detect CyclinD1 expression in the blocks.The relationship between CyclinD1 expression and clinical stage and pathological grade was analysed.HPIAS-1000 high resolution color graphic pathology report management system was used to analyze the quantitative analysis of CyclinD1.The single factor analysis of variance and SN K(q)test were applied to analyze the average optical density of positive particles and the positive area rate of immunohistochemical reaction of each group.Results CyclinD1 was highly expressed in bladder carcinoma but weakly expressed in adjacent tissues,and the difference was significant.Image analysis showed that the average optical density and the positive area rate of CyclinD1 was significantly different between bladder cancer and adjacent tissue(P<0.05).Statistical analysis showed that the expression of CyclinD1 had no significant difference between high and low differentiated groups(P>0.05).Conclusion Abnormal expression of CyclinD1 in bladder carcinoma may be involved in tumorigenesis and development.

Transitional cell carcinoma of bladder; CyclinD1; Immunohistochemistry

R735.2

A

10.3870/zgzzhx.2011.04.013

2011-03-10

2010-06-11

曾文利,女(1970年),漢族,碩士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)