尹將來，馬 瑛，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009)

雜色云芝菌產漆酶條件優(yōu)化及其對堿性紫5BN的降解

尹將來，馬 瑛，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009)

通過實驗對雜色云芝菌產漆酶的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，結果表明雜色云芝菌產漆酶的最佳發(fā)酵條件為:以質量濃度為15 g/L的羧甲基纖維素鈉和質量濃度為1.25 g/L的葡萄糖作為復合碳源，以質量濃度為15 g/L的酵母膏作為氮源，在發(fā)酵72 h時加入濃度為2 mmol/L的2，5－二甲基苯胺，發(fā)酵96 h時加入濃度為2 mmol/L的Cu2+。發(fā)酵培養(yǎng)168 h后酶活力達到3 319.2 U/mL。采用該菌株產漆酶對堿性紫5BN溶液進行脫色處理，當漆酶粗酶液酶活力為0.01 U/mL時，反應10 h，脫色率可達93.91%。

云芝菌;漆酶;發(fā)酵;堿性紫5BN;脫色

漆酶［1－3］是一種含銅的多酚氧化酶，最早由日本人吉田于1883年從漆樹汁液中發(fā)現(xiàn)并因此得名，直至1985年被法國人Bertrand確定為含金屬的氧化酶類［4］。漆酶廣泛分布于真菌、高等植物和昆蟲中，特別是在一些真菌，如擔子菌、多孔菌、子囊菌等中發(fā)現(xiàn)的較多。此外，在一些高等動物中也發(fā)現(xiàn)了漆酶，如Manuel等［5］從牛胃中鑒定獲得一新的漆酶。

隨著工業(yè)技術的發(fā)展，染料廢水因色度高、堿性大、難降解、水量大等特點成為較難治理的工業(yè)廢水［6－8］。堿性紫5BN作為三苯甲烷類染料，被廣泛應用于紡織、印染、油墨等工業(yè)領域。采用物化法降解堿性紫5BN運行費用高，藥劑加入量大，且產生大量難處理的污泥［9－10］。酶催化反應由于反應條件溫和、反應效率高、操作范圍寬，受到越來越多研究者的關注。漆酶在催化過程中產生的惟一副產物是水，因此成為環(huán)境保護用酶的研究熱點［11－13］。目前，國內外對于漆酶降解廢水中有機物的研究展開了大量的工作，并將其應用于難降解工業(yè)有機廢水的治理［14－16］。漆酶的主要生產菌株是大型絲狀真菌擔子菌中的白腐菌，這些菌株普遍存在產酶周期長、產酶量低等問題，使得漆酶的規(guī)模化應用受到限制［17］。

本課題組分離得到一株漆酶生產量高、生長速率快、易培養(yǎng)的雜色云芝菌(Coriolus Versicolor)。本工作對該菌產漆酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并使用粗酶液對染料堿性紫5BN進行降解研究，為漆酶工業(yè)化生產及綠色應用奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

實驗用試劑均為分析純。

雜色云芝菌由本實驗室篩選保藏。

斜面培養(yǎng)基(質量濃度，g/L):麥芽汁30，蛋白胨3，瓊脂20。斜面培養(yǎng)基pH 5.6。

種子培養(yǎng)基(質量濃度，g/L):麥芽汁30，蛋白胨3。種子培養(yǎng)基pH 5.6。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(質量濃度，g/L):葡萄糖15，酵母膏5，KH2PO41，MgSO40.25，CaCl20.05。初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH 3.5。

HVE－50型高壓滅菌鍋:日本Hirayama公司;752型紫外－可見分光光度計:上海舜宇恒平科學儀器有限公司;GL－21M型冷凍離心機:上海市離心機械研究所。

1.2 漆酶粗酶液的制備

斜面培養(yǎng):將保存的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)3 d，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

種子培養(yǎng):用滅菌后的竹簽將斜面上的菌絲刮到含有玻璃珠的30 mL無菌水中，將其打散，然后吸取2 mL菌懸液加入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在25℃、轉速為160 r/min的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3 d。

平遙縣2014年汾河灌區(qū)渠系配套項目實施區(qū)域主要位于縣城西北部，涉及5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)8個行政村，包括四個片區(qū)。一是香樂鄉(xiāng)北薛靳、青落、陶屯、云家莊村4村；二是寧固鎮(zhèn)凈化、魏樂2村；三是古陶鎮(zhèn)新莊村；四是洪善鎮(zhèn)新營村。

發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子以4%(體積分數(shù))的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、轉速為180 r/min的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)一定時間。

取適量發(fā)酵液在4℃、轉速為10 000 r/min的條件下離心10 min，得到上清液即為漆酶粗酶液。

1.3 堿性紫5BN溶液的脫色實驗

將初始質量濃度為10 mg/L的堿性紫5BN溶液加入到一定酶活力的漆酶粗酶液中，在反應溫度為40℃、pH為3的條件下進行脫色反應。

1.4 分析方法

采用2，2'－連氮 －雙(3－乙基并噻 －6－磺酸)(ABTS)法測定酶活力(單位體積酶液中每1 min轉化 1 μmol ABTS 的酶量，U/mL)［18－19］;采用紫外－可見分光光度計在最大吸收波長589 nm處測定堿性紫5BN溶液的吸光度，并計算溶液脫色率。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)時間對雜色云芝菌產漆酶酶活力的影響

在采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基配方的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)時間對漆酶酶活力的影響見圖1。由圖1可見:隨發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長，漆酶酶活力先增大后減小;雜色云芝菌在發(fā)酵培養(yǎng)168 h后漆酶酶活力達到最高值。說明雜色云芝菌在發(fā)酵培養(yǎng)168 h后逐步進入了衰亡期。因此，將雜色云芝菌漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)時間確定為168 h。

2.2.1 單一碳源對漆酶酶活力的影響

改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的配方，考察不同碳源對漆酶酶活力的影響，實驗結果見圖2。由圖2可見:以麥芽糖作為碳源時，漆酶酶活力最低;以羧甲基纖維素鈉作為碳源時漆酶酶活力最高，培養(yǎng)168 h后酶活力達37.5 U/mL。這可能是因為復雜碳源更有利于雜色云芝菌產漆酶。

2.2.2 復合碳源對漆酶酶活力的影響

多糖難以被直接利用，影響菌體生長，但有利于漆酶的分泌;相反單糖則有利于菌的吸收，但不利于漆酶的分泌。因此以質量濃度為15 g/L的羧甲基纖維素鈉與質量濃度為2 g/L的其他碳源組成復合碳源，考察不同復合碳源對漆酶酶活力的影響，實驗結果見圖3。由圖3可見:分別以葡萄糖和蔗糖與羧甲基纖維素鈉形成復合碳源時的漆酶酶活力較高;其中以葡萄糖和羧甲基纖維素鈉作為復合碳源時，培養(yǎng)168 h后產漆酶酶活力可達51.5 U/mL。

以葡萄糖和羧甲基纖維素鈉作為復合碳源，在羧甲基纖維素鈉質量濃度為15 g/L的條件下，ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)對漆酶酶活力的影響見圖4。由圖4可見:隨ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)的增加，漆酶酶活力先增大后減小;當ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)為12時，產漆酶酶活力最高達134.5 U/mL。這是由于葡萄糖作為單糖有利于雜色云芝菌的生長而被優(yōu)先利用，導致羧甲基纖維素鈉的利用過程滯后;隨羧甲基纖維素鈉質量濃度的增加，過多的羧甲基纖維素鈉使培養(yǎng)基的黏性增加，影響其溶氧量，不利于菌體的生長產酶。因此確定復合碳源的最佳配方ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)為12，即羧甲基纖維素鈉的質量濃度為15 g/L，葡萄糖的質量濃度為1.25 g/L。

圖4 ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)對漆酶酶活力的影響

2.3 氮源對雜色云芝菌產漆酶酶活力的影響

改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源——酵母膏的質量濃度，考察酵母膏質量濃度對漆酶酶活力的影響，實驗結果見圖5。由圖5可見，當酵母膏質量濃度為15 g/L時，漆酶酶活力最高。

圖5 酵母膏質量濃度對漆酶酶活力的影響

2.4 誘導劑對雜色云芝菌產漆酶酶活力的影響

2.4.1 不同誘導劑對漆酶酶活力的影響

漆酶是一種誘導酶［20］，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加小分子芳香化合物作為誘導劑可促進漆酶的分泌，提高漆酶產量。在誘導劑加入量為2 mmol/L的條件下，不同誘導劑對漆酶酶活力的影響見圖6。由圖6可見，以2，5－二甲基苯胺作為誘導劑對雜色云芝菌分泌漆酶的誘導作用最明顯，發(fā)酵168 h后漆酶酶活力達到2 305.0 U/mL，是不加誘導劑時的4.4倍。

2.4.2 Cu2+和誘導劑的加入時間對漆酶酶活力的影響

在雜色云芝菌生長前72 h加入誘導劑2，5－二甲基苯胺會明顯抑制菌株的生長發(fā)育，同時產漆酶的能力也會受到影響。這是因為芳香化合物對菌體的生長有明顯的抑制作用，因此選擇適當?shù)募尤霑r間十分重要。研究還表明適量加入Cu2+對真菌產漆酶有一定的促進作用。在Cu2+和誘導劑加入量均為2 mmol/L的條件下，Cu2+和誘導劑的加入時間對漆酶酶活力的影響見圖7。由圖7可見，在發(fā)酵72 h時加入2，5－二甲基苯胺、發(fā)酵96 h時加入Cu2+對雜色云芝菌產漆酶的誘導作用最明顯，發(fā)酵168 h后酶活力達到3 319.2 U/mL。

2.5 漆酶對堿性紫5BN溶液的脫色作用

漆酶粗酶液酶活力對脫色率的影響見圖8。

由圖8可見，隨漆酶粗酶液酶活力的增加，染料溶液的脫色率逐漸降低。這是由于過多的漆酶與小分子介質反應，不僅減少了參與脫色作用的漆酶的量，同時也使ABTS喪失了作為小分子介質促進反應的能力。當漆酶粗酶液酶活力為0.01 U/mL時，反應10 h，脫色率可達93.91%。

3 結論

a)通過對雜色云芝菌進行發(fā)酵培養(yǎng)生產漆酶。實驗結果表明雜色云芝菌產漆酶的最佳發(fā)酵條件為:以質量濃度為15 g/L的羧甲基纖維素鈉和質量濃度為1.25 g/L的葡萄糖作為復合碳源，以質量濃度為15 g/L的酵母膏作為氮源，在發(fā)酵72 h時加入濃度為2 mmol/L的2，5－二甲基苯胺，發(fā)酵96 h時加入濃度為2 mmol/L的Cu2+。發(fā)酵培養(yǎng)168 h后，酶活力達到3 319.2 U/mL。

b)采用所制備的漆酶粗酶液對堿性紫5BN溶液進行脫色處理，當漆酶粗酶液酶活力為0.01 U/mL時，反應10 h，脫色率可達93.91%。

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Cultivation Condition Optimization for Laccase Production from Coriolus Versicolor and Degradation of Basic Violet 5BN

Yin Jianglai，Ma Ying，Jia Honghua，Zhou Hua，Wei Ping

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing Jiangsu 210009，China)

The fermentation conditions for laccase production from Coriolus Versicolor were optimized by experiments.The optimum fermentation conditions are as follows:Using sodium carboxymethy cellulose with 15 g/L of mass concentration and glucose with 1.25 g/L of mass concentration as the complex carbon source;using yeast extract with 15 g/L of mass concentration as the nitrogen source;adding 2，5-dimethylaniline with 2 mmol/L of concentration at the fermentation time for 72 h;adding Cu2+with 2 mmol/L of concentration at the fermentation time for 96 h.When the fermentation time is 168 h，the enzyme activity can reach 3 319.2 U/mL.The solution containing basic violet 5BN was treated using the laccase produced by this strain.When the enzyme activity of the crude enzyme solution is 0.01 U/mL and the treatment time is 10 h，the decolorization rate is 93.91%.

Coriolus Versicolor;laccase;fermentation;basic violet 5BN;decolorization

X791

A

1006－1878(2011)04－0293－05

2011－01－12;

2011－03－03。

尹將來(1986—)，男，江蘇省宜興市人，碩士生，主要研究方向為生物化工。電話 13813366217，電郵leoy_yin@163.com。聯(lián)系人:周華，電話 025 －83172079，電郵 zhouhua@njut.edu.cn。

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2009CB724706);國家自然科學基金資助項目(20906048)。

(編輯 王 馨)