何培新，秦慧迪，劉林飛，吳睿睿

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

食用牛肝菌抽提物最佳提取工藝的研究

何培新，秦慧迪，劉林飛，吳睿睿

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

以食用牛肝菌為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗，研究了外加蛋白酶和纖維素酶輔助抽提風(fēng)味物質(zhì)的最佳工藝。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：液固比8（mL/g）、提取pH6.0、酸性蛋白酶與纖維素酶酶活比400/150、水解溫度60℃、水解時間90min。采用最佳工藝抽提牛肝菌，抽提物中總氮含量1.519%，氨基氮含量0.300%，蛋白質(zhì)水解率19.75%，固形物提取率28.89%。

牛肝菌，風(fēng)味物質(zhì)，單因素實驗，正交設(shè)計

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用牛肝菌 購買于鄭州市調(diào)味品城，原產(chǎn)地為云南省昆明市，含水量86.8%；酸性蛋白酶（5萬U/g）、纖維素酶（4萬U/g） 無錫市雪梅酶制劑科技有限公司。

GF-1高速組織勻漿儀 北京眾益中和生物技術(shù)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SP-2100(723)型分光光度儀 上海光譜儀器有限公司；BS200S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；coolsafe 55-4型真空冷凍干燥器 丹麥Scanlaf公司；SHB-3循環(huán)水環(huán)多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 原料→粉碎→調(diào)配→恒溫水解→滅酶→過濾→上清液真空濃縮→真空冷凍干燥→抽提物粉末

1.2.2 分析方法 總氮測定采取凱氏定氮法進(jìn)行，總氮含量×6.25計算為總蛋白質(zhì)含量[7]；氨基氮測定參照杜善良和張文德報道的方法[8]；蛋白水解率（%）=（提取液中氨基氮/提取液中總氮）×100%；固形物提取率（%）=（提取物干重/樣品干重）×100%。

1.2.3 單因素實驗 以提取液中氨基氮含量（%，w/w干重）為衡量指標(biāo)，利用牛肝菌自身酶系作用，在pH6.0、水解溫度60℃、水解時間90min條件下探討了液固比（4、6、8mL/g）對抽提的影響；液固比為6mL/g時，探討了水解時間（60、90、120min）對抽提的影響；在液固比6mL/g、pH6.0、水解溫度60℃、水解時間90min條件下探討了外加蛋白酶活力（300、400、500U/mL）和纖維素酶活力（100、150、200U/mL）對抽提的影響。

1.2.4 正交實驗 考慮兩種酶制劑作用的適宜溫度（55～65℃）和pH6.0比較一致，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取液固比、水解時間和蛋白酶/纖維素酶酶活比3個因素，每個因素3水平設(shè)計正交實驗如表1。

表1 正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 液固比對抽提的影響 液固比對牛肝菌抽提的影響見圖1。從圖1可以看出，在pH6.0、水解溫度60℃、水解時間90min條件下，抽提物中氨基氮的含量隨液固比的增加而增大，當(dāng)液固比為6mL/g時氨基氮的量已趨于平緩。考慮到液固比過大難以有效增加氨基氮的溶出量，而且還會增加抽提液濃縮的成本，確定抽提的液固比為6mL/g。

圖1 液固比對牛肝菌抽提的影響

圖2 水解時間對牛肝菌抽提的影響

2.1.2 水解時間對抽提的影響 水解時間對牛肝菌抽提的影響見圖2。從圖2可以看出，在pH6.0、水解溫度60℃、水解時間90min條件下，抽提液中氨基氮含量大于水解60min抽提液中氨基氮含量，但與水解120min條件下抽提液中氨基氮含量差異不明顯，因此選擇水解時間90min。

2.1.3 添加蛋白酶對抽提的影響 添加蛋白酶對牛肝菌抽提的影響見圖3。從圖3可以看出，不添加蛋白酶，抽提液中氨基氮含量較低，添加400U/mL蛋白酶，抽提液中氨基氮含量最大，表明添加蛋白酶可有效幫助細(xì)胞自溶，有利于胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，蛋白酶添加量以400U/mL為宜。

圖3 添加蛋白酶對牛肝菌抽提的影響

2.1.4 添加纖維素酶對抽提的影響 添加纖維素酶對牛肝菌抽提的影響見圖4。從圖4可以看出，添加一定活力的纖維素酶，可有效增加抽提液氨基氮的含量；纖維素酶添加量為150U/mL時，抽提液中氨基氮的含量最大，繼續(xù)增大酶用量難以有效提高抽提液的氨基氮含量，故應(yīng)選擇添加纖維素酶活力150U/mL為宜。

圖4 添加纖維素酶對牛肝菌抽提的影響

2.2 正交實驗

每個實驗編號稱取2g牛肝菌，提取后測定抽提液中的氨基氮含量（表2）。從表2可以看出，影響抽提效果的因素大小為：液固比＞水解時間＞酶活比；最佳抽提條件為A3B2C2，即液固比8mL/g，水解時間90min，蛋白酶/纖維素酶酶活比400/150。

2.3 最佳工藝抽提效果

稱取20g牛肝菌粉末，采用優(yōu)化后的最佳工藝條件抽提。真空冷凍干燥后，抽提物為褐色粉末，香氣濃郁，風(fēng)味獨特。產(chǎn)品總氮含量為1.519%，總蛋白含量為9.49%，氨基氮含量為0.300%，蛋白水解率為19.75%，固形物提取率為28.89%。

3 結(jié)論

牛肝菌經(jīng)優(yōu)化工藝液固比8mL/g、提取pH6.0、添加酸性蛋白酶與纖維素酶酶活比400/150、水解溫度60℃、水解時間90min提取后，抽提物中總氮含量為1.519%，氨基氮含量為0.300%，蛋白質(zhì)水解率為19.75%，固形物提取率為28.89%。抽提物香氣濃郁，風(fēng)味獨特，可以用來復(fù)配生產(chǎn)高質(zhì)量菇精類產(chǎn)品，也可作為食品添加劑使用。風(fēng)味物質(zhì)抽提拓展了食用野生牛肝菌的應(yīng)用領(lǐng)域，可提高野生菌產(chǎn)業(yè)的附加值。

表2 正交實驗結(jié)果

[1]李泰輝，宋斌.中國食用牛肝菌的種類及其分布[J].食用菌學(xué)報，2002,9（2）：22-30.

[2]劉佳，殷忠，高敏，等.野生牛肝菌的化學(xué)成分分析及遺傳毒理研究[J].微量元素與健康研究，2007，24（3）：3-5.

[3]周玲仙，殷建忠.云南野生食用牛肝菌營養(yǎng)成分分析及評價[J].食用菌，2008（4）：61-62.

[4]趙謀明，鄭克平.草菇抽提物最佳提取工藝條件的研究[J].食品工業(yè)科技，1997，18(2):35-39.

[5]邵偉，樂超銀，涂志英.蘑菇抽提物工藝研究及菇精的制備[J].中國釀造，2008（16）：102-103.

[6]宋超.金針菇精生產(chǎn)技術(shù)[J].食品工業(yè)，1994(2):35-37.

[7]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(shù)(第2版)[M].北京：高等教育出版社，1997：138-140.

[8]杜善良，張文德.一種快速測定調(diào)味品中氨基酸態(tài)氮的新方法[J].中國調(diào)味品，1998（1）：30-31，6.

Study on the best technology of preparation of flavor extracts from byproducts of Boletus mushrooms

HE Pei-xin,QIN Hui-di,LIU Lin-fei,WU Rui-rui
（School of Food and Biological engineering,Zhengzhou Institute of Light Industry,Zhengzhou 450002,China）

Using edible BoIetus mushrooms as material，based on investigations of single factors，the best technology of preparation of flavor extracts was studied by orthogonal design.The results suggested that the best technology was:ratio of dosage liqueur 8，extraction pH 6.0，activities of mixed protease and cellulose 400/150，extraction temperature 60℃ and extraction time 90min.Under the best technology，the extracts contained (in dry weight)1.519%total nitrogen，0.300%amino nitrogen，and the hydrolytic rate of protein and solids extraction rate was 19.75%and 28.89%，respectively.

BoIetus mushrooms；flavor substances；single-factor investigation；orthogonal design

TS219

B

1002-0306（2011）10-0335-03

牛肝菌是牛肝菌目（Boletales）中具菌管或菌褶類群的種類，多達(dá)28屬，397種或變種，其中199種可食。中國牛肝菌種質(zhì)資源非常豐富，尤以我國西南和華南地區(qū)食用牛肝菌資源最為豐富[1]。牛肝菌為菌根菌，目前尚不能人工栽培。野生牛肝菌子實體粘軟多汁，香滑可口，富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖類物質(zhì)、氨基酸和多種礦物元素，其提取物具有增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗輻射等功能[2]。據(jù)周玲仙和殷建忠測定，云南野生的小美牛肝菌（見手青）（Boletus speciosus）、美味牛肝菌（白牛肝）（B.edulis）等4種牛肝菌具有高蛋白、低脂肪和低熱量的特點，含有豐富的鉀元素，維生素B2含量較高，呈鮮味的谷氨酸和天門冬氨酸含量豐富，占氨基酸總量的20.6%～31.7%[3]。近年來，隨著人們生活水平的提高和消費觀念的改變，提取食用菌風(fēng)味物質(zhì)，與其他調(diào)味原料復(fù)配生產(chǎn)的新一代調(diào)味品—菇精大受歡迎，市場前景廣闊。國內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了從草菇（Volvariella volvacea）[4]、雙孢蘑菇（Agaricusbisporus）[5]、金針菇（Flammulina velutipes）[6]等食用菌子實體提取風(fēng)味物質(zhì)的研究，但沒有見到牛肝菌的相關(guān)研究報道。本文探討了以可食野生牛肝菌為原料，外加蛋白酶和纖維素酶輔助提取風(fēng)味物質(zhì)的工藝技術(shù)，為生產(chǎn)風(fēng)味獨特、具有保健和藥用價值的高質(zhì)量菇精產(chǎn)品和食品添加劑奠定基礎(chǔ)。

2010-06-28

何培新（1970-），男，副教授，博士，主要從事應(yīng)用真菌研究。

中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目（KSCXZ-YW-N-46-02-04）。