吳葛洋，曹雁平，王 蓓，王 瑩，許 楠

（北京工商大學食品學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048）

超聲場對固定化木瓜蛋白酶的影響研究

吳葛洋，曹雁平*，王 蓓，王 瑩，許 楠

（北京工商大學食品學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048）

用殼聚糖-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶后，超聲處理固定化酶能夠提高其活力，但對其最適溫度與最適pH沒有影響。研究了超聲溫度、超聲時間、超聲頻率及超聲強度對固定化酶活力的影響，單因素實驗表明，在水浴溫度50℃，135kHz，0.45W/cm2條件下超聲50min時，酶活力提高最為顯著，較未經(jīng)超聲處理的固定化木瓜蛋白酶活力提高了25.85%。研究低頻槽式超聲處理的固定化酶的動力學，結(jié)果顯示超聲處理使Km值降低，與未經(jīng)超聲處理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%，接近游離酶的Km值，Vmax值升高了8.35%。結(jié)果表明，超聲場使酶與底物的親和力增加。

固定化木瓜蛋白酶，超聲，酶活力，米氏方程

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木瓜蛋白酶、福林酚試劑、L-谷胱甘肽 Sigma公司；殼聚糖、海藻酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；酪蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

多頻槽式處理系統(tǒng)JXD-02型 北京金星超聲波技術(shù)設(shè)備有限公司；低溫恒溫水浴DC-2006 寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外可見分光光度計 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化酶方法 稱取0.4g海藻酸鈉溶于20mL 0.1mol/L pH 7.2的Tris-鹽酸緩沖液中，再加入0.2g殼聚糖粉末，磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻，冷卻至40℃左右，加入0.01g木瓜蛋白酶粉末，攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.5mol/L氯化鈣溶液中形成小球，置于4℃冰箱下30min。

1.2.2 酶活力測定方法 參照福林酚法測定固定化酶活力[9]。

1.2.3 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適條件的影響 28kHz，0.05W/cm2，50℃條件下超聲處理固定化木瓜蛋白酶10min，處理后的固定化酶與pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0的10mg/mL酪蛋白在50℃水浴中反應(yīng)，用方法1.2.2測定酶活力。同條件超聲處理的固定化酶與pH為7.0的10mg/mL酪蛋白在40、50、60、70、80℃水浴中反應(yīng)，用方法1.2.2測定酶活力。未經(jīng)超聲處理的固定化酶在同樣條件下測定酶活力作為對照。

1.2.4 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 研究超聲溫度、超聲時間、超聲頻率和超聲強度對于固定化木瓜蛋白酶的影響。為研究超聲水浴溫度對固定化酶活力的影響，采用28kHz，0.05W/cm2超聲處理固定化酶10min，水浴溫度為30、40、50、60、70、80℃，測定酶活力。為研究超聲時間的影響，采用28kHz，0.05W/cm2，50℃水浴條件下處理固定化酶0、10、20、30、40、50、60min，測定酶活力。為研究超聲頻率的影響，在28、40、50、135kHz，0.05W/cm2，50℃水浴中超聲處理固定化酶，測定酶活力。為研究超聲強度的影響，135kHz，50℃水浴，超聲強度為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45W/cm2處理固定化酶，測定酶活力。

1.2.5 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶動力學的影響經(jīng)28kHz，0.05W/cm2超聲處理10min的固定化木瓜蛋白酶，分別與濃度為1、5、10、15、20mg/mL的酪蛋白進行反應(yīng)，用產(chǎn)物酪氨酸的濃度表示反應(yīng)速率V，單位為U/g·min。使用Lineweaver-Burk plot雙倒數(shù)作圖法計算Km和Vmax值。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適條件的影響

圖1 固定化木瓜蛋白酶的最適pH

最適pH是酶的特性之一，過酸或過堿會導(dǎo)致酶的相關(guān)基團的結(jié)合和解離，酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而喪失活性。對殼聚糖-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的最適pH進行測定，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，pH為6.5時未經(jīng)超聲處理的固定化酶活力為92736U/g，隨著pH升高，酶活力在pH7.0處達到最高值，為102984U/g。當pH繼續(xù)升高，酶活力則有所下降，pH7.5和pH8.0時酶活力為85699、79219U/g。因此固定化木瓜蛋白酶的最適pH在7.0附近。超聲處理沒有改變最適pH的水平和范圍。超聲處理后的固定化酶在pH6.5、7.0、7.5、8.0時酶活力為96628、108346、90790、81956U/g，均較對應(yīng)pH下的非超聲處理酶活力有所提高。值得指出的是，測定固定化木瓜蛋白酶在pH6.0條件下的酶活力時，殼聚糖-海藻酸鈉凝膠發(fā)生溶解，固定化酶小球變得不再完整。

溫度對酶促反應(yīng)具有兩方面影響：溫度升高促進酶與底物分子的運動，從而提高碰撞幾率，使酶促反應(yīng)更容易發(fā)生；但是，溫度升高到一定程度時，蛋白質(zhì)分子會發(fā)生變性，從而改變了活性中心的結(jié)構(gòu)，阻礙酶促反應(yīng)的效率。經(jīng)實驗測定，游離木瓜蛋白酶的最適溫度50℃。對殼聚糖-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的最適溫度的測定結(jié)果如圖2所示。在pH7.0條件下，未經(jīng)超聲的固定化酶與底物酪蛋白反應(yīng)溫度為40、50、60、70、80℃時的酶活力分別為101668、106139、109293、118552、109816U/g，而經(jīng)過28kHz，0.05W/cm2超聲處理10min后，相應(yīng)反應(yīng)溫度下的酶活力分別為107884、111617、115323、122537、115071U/g，固定化后木瓜蛋白酶的最適溫度上升到70℃。經(jīng)過固定化處理后，酶分子受到載體凝膠的影響，對高溫的抵抗增強，所以在較高的溫度下顯示出較強活力。

圖2 固定化木瓜蛋白酶的最適溫度

2.2 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶活力的影響

圖3 超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響

2.2.1 超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響控制超聲溫度為30～80℃，28kHz、0.05W/cm2超聲處理10min后測定固定化木瓜蛋白酶活力。實驗結(jié)果如圖3，經(jīng)過30、40、50℃超聲處理的固定化木瓜蛋白酶活力較未超聲處理的酶活力提高，相對酶活力分別為102.58%、105.57%和108.60%，其中在50℃水浴進行超聲處理的效果最佳，酶活力為117921U/g。隨著超聲溫度繼續(xù)升高，當超聲溫度高于60℃，超聲處理后的固定化酶活力較未超聲處理的酶活力降低，其中60、70、80℃的相對酶活力分別為77.01%、66.73%和63.59%。從實驗結(jié)果可以看出，與低溫區(qū)相比，在高溫區(qū)處理固定化木瓜蛋白酶，酶活力對于溫度變化更為敏感。

2.2.2 超聲時間對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 超聲時間是影響超聲效果的另一個重要因素，時間過長會破壞固定化酶的外部形態(tài)，導(dǎo)致酶游離出來而降低了固定化酶的質(zhì)量和使用次數(shù)；超聲時間過短，則超聲場的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械效應(yīng)等無法對固定化酶起到預(yù)期的作用。在28kHz，0.05W/cm2超聲條件下測定超聲時間對于固定化木瓜蛋白酶活力的影響。從圖4可以看出，超聲處理0～50min內(nèi)，隨著超聲時間的延長，超聲處理的固定化酶相對酶活力有所增加，超聲時間為50min時酶活力相對于非超聲的固定化酶活力提高最顯著，酶活力提高了21.2%，如果繼續(xù)延長超聲時間，相對酶活力則開始下降。故而最佳的超聲時間應(yīng)為50min。

圖4 超聲時間對固定化木瓜蛋白酶活力的影響

2.2.3 超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 不同頻率的超聲對固定化木瓜蛋白酶進行處理，結(jié)果如圖5所示。隨著頻率增大，相對酶活力有上升的趨勢。經(jīng)過28、40、50、135kHz超聲場處理，固定化酶的酶活力較非超聲時的酶活力分別提高了11.11%、12.35%、15.45%和22.69%。135kHz超聲處理后固定化木瓜蛋白酶活力的提高比率顯著高于其他頻率超聲處理的效果。

圖5 超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響

2.2.4 超聲強度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 使用135kHz的超聲波在不同的超聲強度下處理固定化酶，如圖6所示。隨著超聲強度增加，超聲處理對酶活力的提高越為顯著。0.45W/cm2超聲場處理后，固定化木瓜蛋白酶活力為127906U/g，與未經(jīng)超聲處理的固定化木瓜蛋白酶活力提高了25.21%。

圖6 超聲強度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響

2.3 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶動力學的影響

對游離木瓜蛋白酶、固定化木瓜蛋白酶以及超聲處理后的木瓜蛋白酶的動力學值進行測定，用lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算Km和Vmax值，結(jié)果如表2顯示，固定化酶的Km值為2.7624mg/mL，較游離木瓜蛋白酶的Km值1.8528mg/mL提高了49.09%。但是經(jīng)過28kHz、0.05W/cm2超聲處理后Km值降低為1.8835mg/mL，與未經(jīng)超聲處理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%，甚至接近游離酶的Km值。木瓜蛋白酶經(jīng)殼聚糖-海藻酸鈉固定化后，Vmax值從游離酶的23.3645g/U降至16.0514g/U，經(jīng)超聲處理后，固定化木瓜蛋白酶的Vmax有所升高，為17.3913g/U，升高了8.35%。米氏常數(shù)Km表示酶對于底物分子親和力的大小，Km越小，酶對底物的親和力就越大，酶分子與底物分子的有效碰撞次數(shù)也越大[10]。對木瓜蛋白酶酶學動力學的研究結(jié)果表明，超聲處理增加了固定化酶對底物酪蛋白的親和力，增加分子間的有效碰撞幾率，從而增加了酶與底物的親和力，使酶促反應(yīng)更容易發(fā)生。超聲波具有空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械效應(yīng)，會對殼聚糖-海藻酸鈉凝膠的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，改善內(nèi)部通道，促進擴散作用，從而使固定化酶的活性增高。機械效應(yīng)形成的湍流和微擾可能對固定化酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其活性中心更容易暴露，與底物分子接觸。

圖7 木瓜蛋白酶催化反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線

表1 木瓜蛋白酶的米氏方程

表2 木瓜蛋白酶催化反應(yīng)的Vmax和Km

3 結(jié)論

3.1 殼聚糖-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的最適溫度為70℃，最適pH為7.0，超聲處理使固定化木瓜蛋白酶活力提升，但對其最適溫度和pH均沒有影響。

3.2 超聲頻率、超聲功率、超聲溫度以及超聲時間條件均會對超聲處理后的固定化酶活力產(chǎn)生影響。單因素實驗表明，經(jīng)50℃，135kHz，0.45W/cm2條件下超聲處理50min，固定化木瓜蛋白酶酶活力提高最為顯著，較未經(jīng)超聲處理的固定化木瓜蛋白酶活力提升25.85%。馬海樂等[11]研究了變幅桿式超聲對堿性蛋白酶活力的影響，20kHz、80W變幅桿式超聲處理堿性蛋白酶4min，酶活力提升了5.80%。與變幅桿式超聲相比，槽式超聲使用循環(huán)水浴保持恒定溫度，避免了熱效應(yīng)的過度影響。

3.3 經(jīng)過超聲處理后，固定化木瓜蛋白酶的Km值明顯降低，與未經(jīng)超聲處理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%，接近游離酶的Km值，超聲場使酶與底物的親和力增加。超聲場強化酶促反應(yīng)的原因分為兩個方面：其一，超聲場可能改變殼聚糖-海藻酸鈉凝膠的結(jié)構(gòu)，增加內(nèi)部的通道，有利于擴散，從而使底物與酶更加充分接觸，提高固定化酶的活力，在進一步研究中，可以借助電鏡等手段對比證明超聲處理前后殼聚糖-海藻酸鈉凝膠的結(jié)構(gòu)變化；其二，超聲場的作用可能改變酶的結(jié)構(gòu)，使活性位點更容易暴露。陳小麗等[12]研究了超聲處理前后游離木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)變化，結(jié)論顯示超聲處理后酶的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜未發(fā)生改變，而差示光譜出現(xiàn)明顯的正峰和負峰，證明木瓜蛋白酶的構(gòu)型沒有改變，但是構(gòu)象發(fā)生了變化。與游離酶相比，檢測固定化酶結(jié)構(gòu)的研究在國內(nèi)鮮見文獻報道，目前仍是一個研究難點。

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Effect of ultrasonic treatment on immobilized papain

WU Ge-yang,CAO Yan-ping*,WANG Bei,WANG Ying,XU Nan
（School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China）

Chitosan-sodium alginate immobilized papain activity was enhanced by ultrasonic treatment，while the optimal temperature and the optimal pH were not influenced by the treatment.Effect of ultrasonic temperature， ultrasonic treating time，ultrasonic frequency and power on immobilized papain activity was studied.Result of single-factor experiment showed that treating the immobilized papain by 50℃，135kHz，0.45W/cm2ultrasonic for 50min could increase the papain activity most.Immobilized papain activity was enhanced by 25.85%in comparison to the untreated immobilized papain activity.Research on enzyme kinetics of free papain and immobilized papain showed that Km decreased by 31.83%after immobilized papain treated by ultrasonic.Vmax raised 8.35%of the untreated immobilized papain.This result provided the evidence that ultrasonic treatment could raise the affinity of enzyme and substrate.

immobilized papain；ultrasonic；enzyme activity；Michealis-Menten equation

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）10-0142-04

半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶和一些相關(guān)的植物蛋白酶類，如木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶等[1]。木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）的活性位點由Cys25-His159-Asn175組成[2]，能催化水解蛋白質(zhì)的肽鍵和酰胺鍵[3]，在食品、染料和紡織等工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[4]。游離木瓜蛋白酶在高溫等條件下結(jié)構(gòu)受到破壞，酶在水溶液中也容易失去活力，催化效果受到影響。固定化酶技術(shù)可將酶分子以物理或化學方法固定在一定的載體上，使其定向發(fā)生酶促反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，酶可以回收并重復(fù)使用[5]。固定化酶較游離酶穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用，能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化、自動化生產(chǎn)[6]。超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械效應(yīng)能夠增強傳質(zhì)效果，改變大分子結(jié)構(gòu)，故而對提取、分離、水解等化學反應(yīng)具有促進作用[7]。文獻報道表明，利用低頻超聲場處理酶，會對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使其活性位點更容易與底物分子接觸，從而增加反應(yīng)幾率，提高酶活力[8]。本文研究低頻槽式超聲場對固定化木瓜蛋白酶活力的影響，并且從酶學動力學方面探討其影響機理，為進一步闡述和研究超聲場對固定化酶影響的機理提供基礎(chǔ)。

2011-07-25 *通訊聯(lián)系人

吳葛洋（1987-），女，研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。