余 平，劉長姣,2，喬春峰，張守勤*

(1.吉林工商學(xué)院食品工程分院，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025；3.香港賽馬會(huì)中藥研究院，香港 999077)

利用超高壓技術(shù)提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素

余 平1，劉長姣1,2，喬春峰3，張守勤2,*

(1.吉林工商學(xué)院食品工程分院，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025；3.香港賽馬會(huì)中藥研究院，香港 999077)

補(bǔ)骨脂是我國用于生產(chǎn)各種保健品的傳統(tǒng)原料之一，其主要活性成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。本實(shí)驗(yàn)通過回流提取法和超高壓提取法提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的對比實(shí)驗(yàn)，證明超高壓提取法優(yōu)于回流提取法。通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超高壓提取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的提取工藝，得到補(bǔ)骨脂素最優(yōu)提取工藝條件為：壓力100MPa，乙醇體積分?jǐn)?shù) 53%，液固比90:1(mL/g)，提取時(shí)間3min；異補(bǔ)骨脂素的最優(yōu)提取工藝條件為：壓力100MPa，乙醇體積分?jǐn)?shù) 55%，液固比90:1(mL/g)，提取時(shí)間3min。實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用超高壓提取法可以實(shí)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的常溫、快速提取，為其在保健品和功能性食品中的應(yīng)用提供高效的生產(chǎn)方法。

超高壓技術(shù)；補(bǔ)骨脂；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂(Psoralea corylifoliaL.)的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎助陽、納氣、止瀉功效[1]，歷代中醫(yī)常用于治腎虛、滑精、小便頻數(shù)、陽痿、腰膝冷痛、虛寒喘嗽等，外治用于皮膚病、白癲風(fēng)、禿發(fā)等。藥理作用研究證明補(bǔ)骨脂具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、治療骨質(zhì)疏松等作用[2-3]。目前補(bǔ)骨脂廣泛應(yīng)用于各種獨(dú)具功能的營養(yǎng)保健品的生產(chǎn)。

補(bǔ)骨脂中含有多種活性成分，如香豆素類的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂定、黃酮類得補(bǔ)骨脂乙素，單萜類的補(bǔ)骨脂酚等[4-5]。其主要的生物活性成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，研究證明補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素具有抗氧化，促進(jìn)皮膚色素增生，抗腫瘤活性，抗病毒和影響代謝的作用，是獨(dú)具功能的營養(yǎng)因子[6-8]。目前補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的提取方法主要有回流法、超聲提取法和超臨界 CO2流體萃取法[9-10]。回流法提取時(shí)間長不利于熱敏性成分的提取，具有生產(chǎn)周期長、后續(xù)處理工作難、有效成分損失大等缺點(diǎn)；超臨界CO2流體萃取法適合提取極性低的目標(biāo)成分；超聲法工作噪聲比較大，對容器壁的厚薄及容器放置位置要求較高，工業(yè)應(yīng)用有一定的困難；超高壓提取技術(shù)是在常溫高壓條件下，使原料中有效成分迅速溶出，具有提取時(shí)間短、得率高、節(jié)能、無污染、生物活性好等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用超高壓提取技術(shù)提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，并與回流提取法進(jìn)行對比，確定提取方法并建立最優(yōu)提取工藝，為其在保健品中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

補(bǔ)骨脂 河南省新鄉(xiāng)市藥材公司；補(bǔ)骨脂素(批號：110739-200309)、異補(bǔ)骨脂素(批號： 110738-200410) 中國藥品生物制品鑒定所；RJ-TDL-40B離心機(jī) 無錫瑞江儀器廠；超高壓等靜壓機(jī) 上海大隆化工設(shè)備廠；MA110電子分析天平 上海良平儀器儀表廠；臺式快速塑料封口機(jī) 溫州興業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 回流提取法

精確稱取粉碎樣品1g，加入不同提取溶劑并稱質(zhì)量?；亓魈崛?h，放冷至室溫，加入溶劑使回流樣品質(zhì)量與前次稱量質(zhì)量相同，4000r/min離心10min，取上清液1mL于25mL容量瓶中，定容得待測液。

1.3 超高壓提取法

精確稱取粉碎樣品1g，加入不同體積的提取溶液于袋中，密封后進(jìn)行超高壓處理，并保持一定的提取時(shí)間，卸壓后，4000r/min離心10min，取上清液1mL于25mL容量瓶中，定容得待測液。

1.4 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素測定

式中：C為經(jīng)HPLC測定獲得的目標(biāo)成分含量/mg；Vi為提取液總體積/mL；Vj為樣品HPLC的測定體積/mL；M為補(bǔ)骨脂樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法確定

精確稱取粉碎樣品1g，加入不同體積分?jǐn)?shù)分別為55%、70%和90%的乙醇溶液50mL，密封后進(jìn)行超高壓處理，提取壓力300MPa，提取3min，卸壓后4000r/min離心10min.，上清液為待測液，結(jié)果見圖1。

圖1 提取方法對補(bǔ)骨脂素(A)和異補(bǔ)骨脂素(B)得率的影響Fig.1 Effect of extraction methods on the yields of psoralen and isopsoralen

從圖1可知，55%乙醇溶液為提取溶劑時(shí)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率高于提取溶劑為甲醇、95%和75%的乙醇溶液，且超高壓提取法兩種目標(biāo)成分的得率高于回流提取法。Qiao等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂中含有補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷，并推測兩個(gè)苷在水、葡萄糖苷酶存在的條件下，可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的兩個(gè)香豆素，即補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素；在酶被破壞的情況下，則不能轉(zhuǎn)化。以甲醇為溶劑提取時(shí)，原料中的葡萄糖苷酶被甲醇破壞，兩個(gè)苷不能轉(zhuǎn)化為香豆素。以55%乙醇溶液為提取溶劑時(shí)，酶不能被完全破壞，因此存在著苷轉(zhuǎn)化成香豆素的過程，所得補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素得率則偏高。

圖2 補(bǔ)骨脂超高壓和回流提取樣品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of UHPE and reflux extracts from Fructus Psoraleae

超高壓提取樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的得率均高于回流提取樣品。主要是由于超高壓提取是常溫、短時(shí)提取，原料中葡萄糖苷酶破壞較小，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷較多轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。而回流提取過程中溫度偏高，時(shí)間較長，酶活性被破壞，因此轉(zhuǎn)化少，提取率低。從圖2中的4個(gè)成分的峰面積也可以看出，超高壓提取樣品的色譜圖中，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的峰面積較大，但補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的峰面積較小。所以確定采用超高壓法提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間對得率的影響

圖3 提取時(shí)間對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yields of psoralen and isopsoralen

精確稱取粉碎樣品1g，加入體積分?jǐn)?shù)55%乙醇溶液50mL，密封后進(jìn)行超高壓處理，提取壓力300MPa，提取1、3、5、7、9min，卸壓后4000r/min離心10min，上清液為待測液。結(jié)果見圖3。

從圖3可知，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率在提取時(shí)間1～3min內(nèi)增加明顯。當(dāng)提取時(shí)間大于3min，兩目標(biāo)成分的得率無顯著差異，進(jìn)一步體現(xiàn)了超高壓提取的快速優(yōu)勢。這主要是由于高壓能夠提高溶劑滲透速率，加快溶質(zhì)的傳質(zhì)速率[16]，縮短了滲透過程所需的時(shí)間。

2.2.2 液固比對得率的影響

精確稱取粉碎樣品1g，加入體積分?jǐn)?shù)55%乙醇溶液15、35、55、75、95mL，密封后進(jìn)行超高壓處理，提取壓力300MPa、提取3min、卸壓后4000r/min離心10min，上清液為待測液，結(jié)果見圖4。

圖4 液固比對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素得率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the yields of psoralen and isopsoralen

從圖4可知，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率隨液固比的增大而增大。在提取過程中，溶劑用量的增加，可以增加溶劑與有效成分的接觸面積，增大基質(zhì)內(nèi)外的濃度差，促進(jìn)目標(biāo)成分溶解在提取溶劑中，所以隨著溶劑用量的增加補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率隨之增加。但在實(shí)際應(yīng)用中溶劑用量過多將增加后續(xù)工作量與生產(chǎn)成本，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的液固比。

2.2.3 提取溶劑對得率的影響

常用提取溶劑中，乙醇具有溶解性能好、無毒、價(jià)格便宜、來源方便，可回收反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)根據(jù)提取方法對比試驗(yàn)，確定乙醇為提取溶劑。精確稱取粉碎樣品1g，加入體積分?jǐn)?shù)15%、35%、55%、75%、95%的乙醇溶液50mL，密封后進(jìn)行超高壓處理，提取壓力300MPa、提取3min，卸壓后4000r/min離心10min.，上清液為待測液，結(jié)果見圖5。

從圖5可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在15%～55%之間，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于55%時(shí)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率呈下降趨勢，可見較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液更易于目標(biāo)成分的提取。

圖5 提取溶劑對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yields of psoralen and isopsoralen

2.3 優(yōu)化試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，超高壓提取時(shí)間長于3min，對目標(biāo)成分得率的影響較小，因此確定提取時(shí)間為3min，不作為優(yōu)化工藝的考察因素。液固比直接影響補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定液固比在20:1～90:1。提取溶劑乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)確定在35%～75%。從單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于75%時(shí)，得率明顯下降，所以確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%～75%。提取壓力是超高壓提取法中的關(guān)鍵因素，試驗(yàn)選用100～500MPa壓力范圍。采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對超高壓提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1，方差分析見表2。

補(bǔ)骨脂素的最優(yōu)提取條件為壓力100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)53%、液固比90:1，最優(yōu)得率為1.2675%，回歸方程如下：

Y＝0.0007947X1＋0.0859555X2＋0.0204625X3＋0.0000021X12－0.0000143X1X2－0.0000253X1X3＋0.0006297X22－0.0001992X2X3－2.2074169(R＝0.9998)

表1 U10(103)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 U10(103) uniform design and results

表2 均勻試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 2 Analysis of variances of psoralen yield with various extraction conditions

異補(bǔ)骨脂素的最優(yōu)提取條件為：壓力100MPa，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，液固比90:1，最優(yōu)得率1.2014%，回歸方程如下：

Y＝0.0011894X1＋0.0878647X2＋0.0187271X3＋0.0000015X12－0.0000158X1X2－0.0000239X1X3－0.0006435X22－0.0001796X2X3－2.3108594(R＝0.9996)

由優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在53%～55%之間有利于補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的提取，這主要與補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的極性相關(guān)，可用相似相溶原理解釋，同時(shí)在此乙醇體積分?jǐn)?shù)下，葡萄糖苷酶可以促進(jìn)補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷向補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素轉(zhuǎn)化。在100～500MPa范圍內(nèi)，低壓力易于補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的提取，低壓力可減小對葡萄糖苷酶的破壞作用，又可加快溶質(zhì)的擴(kuò)散速率，提高提取率。此外超高壓提取可以實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)完成提取，提取時(shí)間僅為3min，低于回流提取時(shí)間。這主要是由于超高壓可以加快溶劑的滲透速率，并可在一定程度上降低細(xì)胞結(jié)構(gòu)對傳質(zhì)的阻力，加快傳質(zhì)速率，因此可以大大縮短提取時(shí)間。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過回流提取和超高壓提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的對比試驗(yàn)，確定超高壓提取法為提取方法。通過單因素試驗(yàn)確定優(yōu)化試驗(yàn)因素與各因素的水平，利用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法確定補(bǔ)骨脂素的最優(yōu)提取條件為壓力100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)53%、提取時(shí)間3min、液固比90:1(mL/g)，異補(bǔ)骨脂素的最優(yōu)提取條件為壓力100MPa、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、液固比90:1(mL/g)、提取時(shí)間3min。最優(yōu)條件下補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率分別為1.2675%和1.2014%。超高壓提取實(shí)現(xiàn)了常溫快速提取，提高了目標(biāo)成分得率，縮短提取時(shí)間，提高了提取效率，為補(bǔ)骨脂活性成分的提取提供了一種更加高效的方法。

[1] 國家藥典委員會(huì). 中國藥典:Ⅰ部[S]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:129.

[2] 黃劍, 趙陸華, 鄒巧根, 等. 補(bǔ)骨脂化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)進(jìn)展, 2000, 24(4): 212-214.

[3] 郭江寧, 吳侯, 翁新楚, 等. 補(bǔ)骨脂中活性成分的提取分離與抗癌實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中藥材, 2003, 26(3): 185-187.

[4] 吉力, 徐植靈. 補(bǔ)骨脂化學(xué)成分的綜述[J]. 中國中藥雜志, 1995, 20(2): 120-123.

[5] 呂娟, 林海東, 李仲然, 等. 補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 13(3): 220-223.

[6] GUO Jiangning, WENG Xinchu, WU Hou, et al. Antioxidant activity of compounds isolated fromPsoralea corylifoliaL.[C]//The 3rdInternational Conference on Natural Products: Natural Products -a Must for Human Survival ABSTRACTS. 南京: 南京大學(xué)科技處, 2004.

[7] 吳少華, 張仲海, 趙建斌. 補(bǔ)骨脂素體內(nèi)外抗癌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中藥雜志, 1998, 23(5): 303-306.

[8] 郭秀芝, 劉衛(wèi)萍, 楊杰. 補(bǔ)骨脂的藥理活性及其開發(fā)利用[J]. 中醫(yī)藥藥學(xué)報(bào), 2005, 33(5): 52-53.

[9] 白鴿, 曹學(xué)麗, 譚莉, .補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的分離純化研究[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 27(5): 1-5.

[10] 黃芳, 黃曉芬, 梁衛(wèi)萍, 等. 超臨界CO2流體從補(bǔ)骨脂中提取分離補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及脂肪油的工藝研究[J]. 中藥材, 2000, 23(5):266-267.

[11] ZHANG Shouqin, ZHU Junjie, WANG Changzhen. Novel high pressure extraction technology[J]. International Journal of Pharmaceutics,2004, 27(8): 471-474.

[12] ZHANG Shouqin, XI Jun, WANG Changzheng. Effect of high hydrostatic pressure on extraction of flavonoids in propolis[J]. Food Science and Technology International, 2005, 11(3): 213-216.

[13] LEMAY P. The use of high pressure for separation and production of bioactive molecules[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1595:357-366.

[14] QIAO Chunfeng, HAN Quanbin, MO Shifu, et al. Psoralenoside and Isopsoralenoside, two new benzofuran glycosides fromPsoralea corylifolia[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2006, 54(5): 714-716.

[15] QIAO Chunfeng., HAN Quanfin, SONG Jingzheng, et al. Quality assessment ofFructus Psoraleae[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2006, 54(6): 887-890.

[16] SADUS R J. High pressure phase behaviour of multicomponent fluid mixtures[M]. Amsterdam: Elsevier, 1992.

Application of Ultra High Pressure Technology in Extraction of Psoralen and Isopsoralen fromFructus Psoraleae

YU Ping1，LIU Chang-jiao1,2，QIAO Chun-feng3，ZHANG Shou-qin2,*
(1. Branch of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130062, China；2. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130025, China；3. Institute of Chinese Medicine, Hong Kong Jockey Club, Hong Kong 999077, China)

Fructus Psoraleaeis one of the most popular raw materials for health products in China. The major bioactive components ofFructus Psoraleaeare psoralen and isopsoralen. In the present work, ultra high pressure extraction (UHPE) was used to extract psoralen and isopsoralen fromFructus Psoraleaeand compared with the reflux extraction. We found that UHPE resulted in higher yields of psoralen and isopsoralen than the refulx extraction. Using a uniform design, the optimum UHPE conditions including pressure, ethanol concentration, liquid-to-solid raio (mL/g) and extraction time were determined to be 100 MPa, 53%, 90:1 and 3 min for psoralen and 100 MPa, 55%, 90:1 and 3 min for isopsoralen, respectively. UHPE proved to enable normal temperature and rapid extraction of psoralen and isopsoralen, thereby providing an efficient production approach for applying psoralen and isopsoralen in health products and functional products.

ultra high pressure extraction；Fructus Psoraleae；psoralen；sopsoralen

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0039-05

2011-06-29

國家自然科學(xué)基金面上基金項(xiàng)目(30472135)

余平(1963—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：vikyliu@126.com

*通信作者：張守勤(1946—)，男，教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取工藝及設(shè)備。E-mail：zsq@163.com