張曉毅，趙美美，于 新,﹡

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225）

綠色木霉菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)黃色素動(dòng)力學(xué)模型的建立

張曉毅1，2，趙美美1，于 新1,﹡

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225）

為構(gòu)建綠色木霉菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)黃色素動(dòng)力學(xué)模型，在綠色木霉菌分批發(fā)酵過(guò)程中測(cè)定了菌體干重、總糖濃度、黃色素色價(jià)和pH變化，使用Origin軟件將經(jīng)典發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程擬合后得到綠色木霉菌菌體生長(zhǎng)、黃色素合成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型及參數(shù)。結(jié)果表明，模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩者能較好地?cái)M合，可以較好地預(yù)測(cè)發(fā)酵過(guò)程。

綠色木霉菌，分批發(fā)酵，黃色素，動(dòng)力學(xué)模型

食用色素是食品調(diào)色的重要原料之一，是食品添加劑的重要門類。近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵色素逐漸成為生產(chǎn)天然色素的熱點(diǎn)，由于其成本較低，且無(wú)毒、安全、轉(zhuǎn)化率高，發(fā)展前景十分廣闊。木霉菌（Trichoderma spp.）屬于半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，絲孢科，粘孢菌類，是一類普遍存在的真菌。國(guó)內(nèi)利用微生物產(chǎn)天然黃色素主要集中在對(duì)紅曲霉菌株資源的利用上[1]，鮮見(jiàn)有關(guān)于綠色木霉菌（Trichoderma viride）代謝產(chǎn)生黃色素的研究。Betina等[2]對(duì)T.viride所代謝的黃色素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明其包含的兩種黃色素為結(jié)構(gòu)已知的蒽醌類物質(zhì)。吳曉冰[3]等對(duì)綠色木霉菌T.viride發(fā)酵產(chǎn)生的黃色素進(jìn)行了穩(wěn)定性的初步研究，發(fā)現(xiàn)該黃色素具有較好的穩(wěn)定性。黃色素作為三原色之一，是重要的色素品種，在食品及飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品行業(yè)乃至紡織工業(yè)方面占據(jù)著舉足輕重的地位。本文對(duì)綠色木霉菌產(chǎn)黃色素的液態(tài)分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，對(duì)菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、黃色素合成動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)進(jìn)行曲線擬合并建立了動(dòng)力學(xué)模型，以期定向控制黃色素的產(chǎn)生，為天然黃色素的發(fā)酵生產(chǎn)提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色木霉菌（Trichoderma viride） 購(gòu)于廣東微生物研究所；Na2HPO4、NaOH、瓊脂、乙醇、乙酸、三氯乙酸、乙酸鈉、鄰聯(lián)甲苯胺 均為分析純，天津大茂化工廠；葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶 上海羅氏公司；藥品、試劑除特別注明外 均為分析純。

UV-1700型紫外可見(jiàn)光譜分析儀日本島津公司；FA1004型分析天平 上海良平公司；LS-B35型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；SZ-93自動(dòng)雙蒸水器 上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-IF型單人雙面無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；SHZ-3水環(huán)式真空泵 河南鞏義杜莆儀器廠；低溫冷藏箱 海爾；JJ500精密電子天平 美國(guó)G&G公司；800型電動(dòng)離心機(jī) 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；實(shí)驗(yàn)中所用玻璃器具均洗凈，用蒸餾水淋洗。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。將綠色木霉菌T.viride母種在PDA斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面劃線法轉(zhuǎn)種活化，28℃培養(yǎng)5d。

孢子懸液制備：從斜面挑取孢子至無(wú)菌水中混合均勻，使孢子濃度達(dá)到105～106CFU/mL。

1.2.2 黃色素的發(fā)酵培養(yǎng) 稱取馬鈴薯→自來(lái)水加熱煮沸30min→過(guò)濾→調(diào)配各成分濃度→分裝到各錐形瓶→滅菌（121℃，20min）→接種→發(fā)酵培養(yǎng)（35℃，120r/min）

錐形瓶裝液量50mL/250mL，接種孢子懸液5mL，30℃、120r/min空氣恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)9d，間隔24h取樣測(cè)定各動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.3 測(cè)定方法 菌絲生物量的測(cè)定：將發(fā)酵原液用經(jīng)恒重的濾紙抽濾，將濾紙和菌絲體在105℃烘至恒重，稱量即可求得菌體生物量[4]。pH的測(cè)定：pH計(jì)法。葡萄糖測(cè)定：葡萄糖氧化酶法。發(fā)酵液色價(jià)的測(cè)定：準(zhǔn)確取一定體積發(fā)酵原液濾液，加蒸餾水稀釋40倍，用分光光度計(jì)在380nm處[2]測(cè)定吸光值，色素色價(jià)（U/mL）以吸光值與稀釋倍數(shù)的乘積來(lái)表示，計(jì)算方法如下：

式中，E-發(fā)酵液色價(jià)；U-色素的含量單位；A-樣品溶液的Abs值；R-發(fā)酵原液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃色素發(fā)酵過(guò)程代謝變化

圖1 綠色木霉菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程代謝變化曲線

對(duì)綠色木霉菌進(jìn)行分發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24h取樣分別測(cè)定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度、菌體干重、色價(jià)和pH，結(jié)果見(jiàn)圖1及圖2。由圖1可見(jiàn)，綠色木霉菌生長(zhǎng)延遲期較短，發(fā)酵24h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體及黃色素濃度迅速增加，發(fā)酵液葡萄糖濃度逐漸下降，隨著葡萄糖基質(zhì)的消耗，菌體和黃色素濃度趨于穩(wěn)定。發(fā)酵120h時(shí)，菌體量達(dá)到0.22675g，黃色素濃度為15.0U/mL。另外，黃色素的增長(zhǎng)率在發(fā)酵50h之后與菌體生長(zhǎng)增長(zhǎng)率接近，色素生成曲線與菌體生長(zhǎng)接近平行，因此可以確定綠色木霉菌黃色素的發(fā)酵過(guò)程是生長(zhǎng)偶聯(lián)型。發(fā)酵3～7d，菌體處于生長(zhǎng)穩(wěn)定階段，培養(yǎng)基中菌絲球體積變大，菌體干重達(dá)到最大值（0.2268mg/mL），發(fā)酵液的pH變化不大，說(shuō)明此階段代謝產(chǎn)物生成較少或合成了中性的次級(jí)代謝物質(zhì)。

圖2 綠色木霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中pH及葡萄糖濃度的變化

式中：μm為菌體最大生長(zhǎng)速率；Cx為菌體干重（g）；Cx,max為最大菌體干重（g），當(dāng)t=0時(shí)，Cx=C0。

該方程的積分式為：

2.2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)最常用的方程有Logistic方程和Monod方程，其中Logistic模型是一個(gè)典型的S型曲線[4]，能很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中普遍存在的菌體干重增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用。由綠色木霉菌菌體生長(zhǎng)曲線可知，當(dāng)菌體生長(zhǎng)過(guò)了對(duì)數(shù)期之后，菌體重量不再增加，原因是發(fā)酵液達(dá)到最大細(xì)胞質(zhì)量濃度后阻礙了綠色木霉菌菌體的生長(zhǎng)。因此，將Logistic方程應(yīng)用于綠色木霉菌菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型[5]。

Logistic方程：

將實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果C0=0.0356（g），Cx,max=0.2268（g）代入方程，得：

利用Origin7.5軟件對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合（圖3）,可得μm=0.04816h-1。因此,菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型方程為：

圖3 菌體生長(zhǎng)擬合曲線

對(duì)所測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖3可看出，黃色素菌體生長(zhǎng)擬合曲線與實(shí)測(cè)值能較好地吻合，基本上反映了綠色木霉菌菌體的生長(zhǎng)情況。

2.3 黃色素合成動(dòng)力學(xué)模型

根據(jù)經(jīng)典的描述微生物產(chǎn)物合成的動(dòng)力學(xué)模型，采用Leudeking-Piret模型：

根據(jù)產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系，Gaden[6]將產(chǎn)物形成分成3類：a.產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)相偶聯(lián)；b.產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)；c.產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有關(guān)系。Luedeking和Piret為此總結(jié)下式來(lái)描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系：當(dāng)α=0，β≠0時(shí)，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)關(guān)；α≠0，β≠0時(shí)，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)；α≠0，β=0時(shí)，產(chǎn)物形成為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。根據(jù)2.1所得出的結(jié)論，黃色素的形成與細(xì)胞生長(zhǎng)是偶聯(lián)關(guān)系，因此采用產(chǎn)物形成偶聯(lián)動(dòng)力學(xué)模型[7]：

式中，p為用色價(jià)來(lái)表征的黃色素產(chǎn)量，U/mL；α為與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)常數(shù)。

將式（2）代入方程，積分得：

式中，C0=0.0356（g），Cx，max=0.2268（g），μm=0.04816（h-1），代入方程，利用Origin7.5軟件軟件對(duì)黃色素產(chǎn)生動(dòng)力方程進(jìn)行非線性擬合，求得α=5.618，因此黃色素合成動(dòng)力方程為：

圖4 黃色素合成擬合曲線

2.4 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)

在本發(fā)酵過(guò)程中，以葡萄糖為限制性基質(zhì)，葡萄糖作為唯一碳源，主要用于發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)消耗、維持其代謝活動(dòng)和生成黃色素消耗三部分，由于維持其代謝活動(dòng)和生成黃色素消耗的底物量很少，可歸結(jié)為菌體生長(zhǎng)消耗部分，故基質(zhì)消耗可用與Luedeking-Piret相似的方程式表示[8-9]：

將C0=0.0356（g）和S0=0.02（g/mL）代入得：

利用Origin7.5軟件按得到的式（4）對(duì)發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖實(shí)測(cè)值進(jìn)行非線性擬合，可得b=0.4886,結(jié)果見(jiàn)圖5，得到基質(zhì)消耗量（S）隨時(shí)間變化的函數(shù)：

從擬合圖形來(lái)看（圖5），所選的基質(zhì)消耗模型基本可以準(zhǔn)確地反映發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗的實(shí)際情況。

圖5 基質(zhì)（葡萄糖）消耗擬合曲線

3 結(jié)論

在綠色木霉菌產(chǎn)黃色素的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)測(cè)定菌體干重、葡萄糖濃度、色價(jià)和pH，經(jīng)數(shù)據(jù)擬合后得到菌體生長(zhǎng)、黃色素合成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型及參數(shù)。從綠色木霉菌產(chǎn)黃色素的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程曲線可以得出綠色木霉菌體生長(zhǎng)和黃色素的合成屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型，因此從其發(fā)酵過(guò)程類型來(lái)看，黃色素的產(chǎn)生可能直接來(lái)源于初級(jí)代謝[10]。結(jié)合圖1綠色木霉菌黃色素合成曲線，黃色素量在發(fā)酵中后期反而有所下降，推測(cè)部分黃色素作為前提物質(zhì)參與了次級(jí)代謝過(guò)程[11]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)綠色木霉菌液態(tài)發(fā)酵黃色素動(dòng)力學(xué)的初步研究所得到的結(jié)果，我們將在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，逐漸加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減少其對(duì)產(chǎn)物合成的阻遏作用[12]，避免高濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)代謝產(chǎn)物的抑制作用，提高發(fā)酵產(chǎn)量。

本研究通過(guò)Logistic方程和Luedeking-Piret方程提出模型，應(yīng)用Origin7.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算，得到了可用于菌體生長(zhǎng)、黃色素合成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)曲線且能較好地?cái)M合，得出的綠色木霉菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)黃色素的過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)揭示了黃色素發(fā)酵代謝的基本特征，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有一定的參考依據(jù)。

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Kinetices model establishing for yellow pigment of Trichoderma viride by liquid state fermentation

ZHANG Xiao-yi1,2,ZHAO Mei-mei1,YU Xin1,*

（1.College of Tea and Food Science and Engineering,Anhui Agricultural Unversity,Hefei 230036,China；2.College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China）

In order to set up the kinetices model with the liquid state fermentation of yellow pigment by Trichoderma viride，during the producing of yellow pigment，the net weight of thallus，the density of total suger，valeur and pH degree were tested.Then classical fermentation kinetic equation of yellow pigment was simulated with the origin software.Results showed that they matched well，and the models can predict fermentation perfectly.

Trichoderma viride；batch fermentation；yellow pigment；kinetices model

TS202.3

A

1002-0306（2011）10-0089-04

2010-12-07 *通訊聯(lián)系人

張曉毅（1985-），男，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（30871765）。