王令充，劉 睿，鄭文文，吳 皓，*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046；2.江蘇省海洋藥物研究開發(fā)中心，江蘇南京 210029）

酶解制備四角蛤蜊抗氧化活性肽的工藝研究

王令充1，2，劉 睿1，2，鄭文文1，吳 皓1，2，*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046；2.江蘇省海洋藥物研究開發(fā)中心，江蘇南京 210029）

為了充分利用四角蛤蜊肉渣，將其酶解制備成有抗氧化活性的產(chǎn)物。首先通過酶解產(chǎn)物的抗氧化活性比較，篩選出四角蛤蜊肉渣的最適水解酶為胰蛋白酶，單因素實驗考察了胰蛋白酶的水解條件；以水解溫度、時間、pH及加酶量為關(guān)鍵因素，合理選取單因素實驗所得因素水平，進(jìn)行正交工藝實驗，得到最佳酶解工藝。結(jié)果表明：當(dāng)胰蛋白酶用量占底物總重的0.5%時、溫度45℃、pH為8.5、酶解90min所得到的酶解液的抗氧化活性最強(qiáng)。

四角蛤蜊，酶解工藝，抗氧化活性，多肽

大量研究證明，肽和蛋白類成分是一種良好的抗氧化劑[1]。特別是介于一定分子量范圍的小肽具有超強(qiáng)抗氧化、防衰老活性[2]，其能夠有效清除體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，對維護(hù)人體的健康平衡具有重要的意義。這些具有抗氧化活性的小肽可以通過酶解大分子蛋白質(zhì)得到，如酶解魚皮膠原、酶解大豆粉、酶解牡蠣等[3-5]。四角蛤蜊是我國沿海常見的雙殼軟體貝類，資源量巨大，其肉體不僅可以食用，還具有藥用價值。本課題組已進(jìn)行了提取四角蛤蜊降血糖活性成分的研究，發(fā)現(xiàn)多糖是其主要的活性成分[6]，經(jīng)提取多糖的蛋白質(zhì)殘渣則基本無活性，常被丟棄。為了充分利用原料資源，實現(xiàn)四角蛤蜊醫(yī)藥產(chǎn)品的清潔生產(chǎn)，本文對四角蛤蜊提取后的肉渣使用酶解工藝進(jìn)行加工，制成具有抗氧化功能活性且易于人體吸收的蛋白多肽。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

3貝齡四角蛤蜊 采自江蘇省南通洋口港，經(jīng)江蘇省海洋水產(chǎn)研究所萬夕和研究員鑒定為蛤蜊科四角蛤蜊屬生物，所采原料經(jīng)清水吐沙后取肉棄殼、加水煎煮、過濾、留殘渣備用[6]，水分52.7%、蛋白質(zhì)39.1%、粗脂肪含量為4.8%；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶 比活500U/mg，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶 比活500U/mg，南京奧多福尼生物科技有限公司；Pierce BCA蛋白定量試劑盒 美國Thermo公司；二苯代苦味酰肼（DPPH） 分析純，美國Alfa公司。

BP 211D電子天平 德國Sartorious公司；Rotavapor R－210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國BUCH I公司；Spectra Max 190酶標(biāo)儀 美國AD公司；中空纖維膜組件 截留分子量30ku，天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司；JJ－2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市榮光儀器制造公司；Avanti J－25高速冷凍離心機(jī) 德國Backman公司；DW－1增力無極恒速攪拌器 南京科爾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最佳水解用酶的選取 將四角蛤蜊煎煮后的殘渣洗凈、攪碎、勻漿，加入3倍重量的水配成混懸液，再分別加入比活為500U/mg的4種水解酶（胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶），加酶量為勻漿液重量的0.2%，在各自標(biāo)注最佳條件（胰蛋白酶：50℃，pH=8.0；木瓜蛋白酶：55℃，pH=5.5；中性蛋白酶：50℃，pH=7.0；胃蛋白酶：37℃，pH=2.0）下進(jìn)行2h酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后在90℃水浴滅活酶10m in，4000r/m in離心15m in，取上清液進(jìn)行超濾（截留分子量30ku），超濾液低溫減壓濃縮至原勻漿液體積，得四種不同的四角蛤蜊肉渣酶解液。對所得的水解液進(jìn)行體外抗氧化活性測定：采用普魯士藍(lán)反應(yīng)法測定不同四角蛤蜊酶解液的還原能力[7]；采用褪色光度法測定不同酶解液對Fenton體系產(chǎn)生羥自由基的清除率[8]；根據(jù)Huang和Mau的方法測定酶解液的體外DPPH自由基的活性[9]；采用鄰苯三酚自氧化法測定酶解液的超氧陰離子自由基清除能力[10]。

1.2.2 胰蛋白酶酶解工藝的單因素實驗

1.2.2.1 酶解溫度 將四角蛤蜊水煎煮肉渣洗凈、攪碎、勻漿，加入3倍重量的水配成混懸液，再分別加入比活為500U/mg的胰蛋白酶，加酶量為勻漿液重量的0.5%，在pH8.0，酶解反應(yīng)時間120min的條件下，考察溫度因素對產(chǎn)物多肽抗氧化活性影響，分別考察40、45、50、55、60、65℃酶解得到的四角蛤蜊水解多肽對羥自由基的清除率活性。

1.2.2.2 酶解時間 將四角蛤蜊水煎煮肉渣洗凈、攪碎、勻漿，加入3倍重量的水配成混懸液，再分別加入比活為500U/mg胰蛋白酶，加酶量為勻漿液重量的0.5%，在pH 8.0，溫度50℃的條件下，考察酶解反應(yīng)時間對產(chǎn)物多肽抗氧化活性的影響，分別考察20、40、60、80、100、120min酶解得到的四角蛤蜊蛋白多肽對羥自由基的清除率活性。

1.2.2.3 酶解最適pH 將四角蛤蜊水煎煮肉渣洗凈、攪碎、勻漿，加入3倍重量的水配成混懸液，再分別加入比活為500U/mg的胰蛋白酶，加酶量為勻漿液重量的0.5%，溫度50℃下酶解80min，考察酶解反應(yīng)pH對產(chǎn)物多肽抗氧化活性的影響，分別考察pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0時酶解得到的四角蛤蜊蛋白多肽對羥自由基的清除率活性。

1.2.2.4 加酶量 將四角蛤蜊水煎煮肉渣洗凈、攪碎、勻漿，加入3倍重量的水配成混懸液，再分別加入比活為500U/mg的胰蛋白酶，在pH=8.5、溫度50℃下酶解80min，考察加酶量對產(chǎn)物多肽抗氧化活性的影響，考察酶－底物比（酶－底物比按加酶量占勻漿液總重量的百分比計）分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%時酶解得到的四角蛤蜊蛋白多肽對羥自由基的清除率活性。

1.2.3 正交實驗 選取酶解pH、溫度、加酶量和酶解時間四個因素，每個因素在單因素篩選結(jié)果數(shù)值附近選3個水平，選用L9（34）正交實驗，對胰蛋白酶水解四角蛤蜊工藝進(jìn)一步的優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳水解用酶的選取

表1 四種蛋白酶酶解液的體外抗氧化能力（濃度5mg/mL±SE，n=3）

表1 四種蛋白酶酶解液的體外抗氧化能力（濃度5mg/mL±SE，n=3）

超氧離子自由基胰蛋白酶 72.12±4.94 73.62±2.04 67.34±3.46 1.49±0.059木瓜蛋白酶 29.27±1.41 23.88±1.57 45.78±8.94 0.68±0.084中性蛋白酶 45.75±3.10 14.30±1.11 40.26±2.98 1.08±0.041胃蛋白酶 63.68±4.87 40.02±9.83 53.31±2.11 1.79±0.562酶解液 羥基自由基自由基清除率（%） 還原能力（OD值）DPPH自由基

四種酶解液的體外抗氧化能力見表1。實驗結(jié)果表明，所選的4種蛋白水解酶中，胰蛋白酶水解液對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力均強(qiáng)于木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶。實驗結(jié)果還表明，四角蛤蜊肉渣胃蛋白酶酶解液還原能力最強(qiáng)，且對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力強(qiáng)于木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。因此水解四角蛤蜊肉渣的蛋白酶優(yōu)選胰蛋白酶或者胃蛋白酶作為最佳用酶，水解酶優(yōu)選胰蛋白酶。由于羥自由基清除率是反映抗氧化作用的最重要指標(biāo)，故研究以清除羥自由基能力作為考察指標(biāo)，進(jìn)行胰蛋白酶酶解工藝的考察和優(yōu)化。

2.2 胰蛋白酶酶解工藝的單因素考察

2.2.1 酶解溫度 結(jié)果見圖1所示，由結(jié)果可知，在溫度45～50℃時羥自由基清除率達(dá)峰值，這是因為該溫度下酶活最強(qiáng)，活性多肽得率最高，所以抗氧化活性最強(qiáng)；當(dāng)溫度在50℃以上時，溫度開始對酶活起抑制作用，使底物降解、生成目的產(chǎn)物的速率下降。因此，最適宜四角蛤蜊肉渣胰蛋白酶的酶解溫度為45～50℃。

圖1 酶解溫度的影響

2.2.2 酶解時間 結(jié)果見圖2所示。實驗結(jié)果表明，隨著酶解時間的延長，酶解液的羥自由基清除率逐漸增加，反應(yīng)時間在80m in時羥自由基清除率處于峰值；但時間超過80m in時，隨著反應(yīng)時間的延長，清除率反而下降，這是因為隨時間的延長，在水解成分的條件下，活性多肽進(jìn)一步被酶解成無活性的小肽，所以酶解液整體活性降低。因此，選擇酶解時間為40～80m in為宜。

圖2 酶解時間的影響

2.2.3 酶解最適pH 結(jié)果見圖3所示。實驗結(jié)果表明，在堿性pH范圍7.5～8.5間，所得酶解液的羥自由基清除率較優(yōu)，當(dāng)pH為8.5時，酶解液的羥自由基清除率最大，而pH大于8.5時羥自由基清除率遞減，說明在pH 7.5～8.5左右是酶作用于底物產(chǎn)生活性肽的最佳pH范圍。因此，最適宜四角蛤蜊肉渣胰蛋白酶水解pH為7.5～8.5。

圖3 酶解pH的影響

2.2.4 加酶量 結(jié)果見圖4所示。實驗結(jié)果表明，不加酶時勻漿液濾過組分的羥自由基清除率僅為41.23%，而在酶－底物比為0.05%時酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率高達(dá)79.7%；隨著酶－底物比的增大，產(chǎn)物的羥自由基清除率逐漸增加，在酶－底物比增大到0.25%時，產(chǎn)物的羥自由基清除率達(dá)最大；然而，增大酶－底物比超過0.25%時，產(chǎn)物的羥自由基清除率呈現(xiàn)下降趨勢。其原因為：隨著酶濃度的增加，其底物逐漸達(dá)到飽和，當(dāng)出現(xiàn)酶濃度過飽和時，過飽和的酶就可能會作用于具有活性的多肽，使其降解生成無活性的小肽，而降低活性肽的含量。因此，胰蛋白酶加入量占四角蛤蜊蛋白勻漿液重量百分比為0.25%～0.5%為宜。

圖4 加酶量的影響

2.3 胰蛋白酶酶解工藝正交實驗

正交實驗設(shè)計結(jié)果如表2和表3所示。

表2 正交實驗結(jié)果及極差分析

表3 胰蛋白酶酶解物對羥自由基清除作用方差分析表

由表2中R值及表3中方差分析可知，影響酶解液羥自由基清除作用的主次因素為pH＞水解時間＞溫度＞加酶量，進(jìn)一步的顯著性檢驗表明，pH對酶解產(chǎn)物自由基清除達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。因此根據(jù)正交實驗直觀分析結(jié)果，四角蛤蜊肉渣胰蛋白酶水解的最適宜條件是pH為8.5，溫度45℃，時間90m in，酶－底物比為0.5%，和單因素考察實驗結(jié)果差別不大。

3 結(jié)論

四角蛤蜊肉渣的蛋白酶酶解產(chǎn)物為一組混合的肽類物質(zhì)，其中以胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最好，具有較強(qiáng)的清除自由基和還原能力。以胰蛋白酶對四角蛤蜊肉渣進(jìn)行酶解制備抗氧化活性肽的最優(yōu)條件為pH為8.5，溫度45℃，時間90min，酶－底物比為0.5%。所得產(chǎn)物在實驗濃度下，清除DPPH自由基能力能夠高達(dá)80%，其效果堪比同濃度的人工合成抗氧化劑。

高效、安全的天然抗氧化劑是未來食品添加劑市場的發(fā)展方向，實驗證明四角蛤蜊肉渣酶解液中含有高效的抗氧化物質(zhì)，主要是一些肽類成分。由于四角蛤蜊肉渣是加工的廢棄物，以酶解工藝制備功能活性產(chǎn)品，既有利于清潔生產(chǎn)，保護(hù)環(huán)境，又具有十分廣闊的市場前景。同時，本研究也可為進(jìn)一步分離純化四角蛤蜊抗氧化多肽提供工作基礎(chǔ)。

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[10]凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

Enzymolysis of fresh residue of Mactra veneriform is to prepare antioxidative products

WANG Ling-chong1,2,LIU Rui1,2,ZHENGW en-wen1,WU Hao1,2,*

（1.College of Pharmaceutical Science,Nanjing University of Chinese medicine,Nanjing 210046，China；
2.Marine Research Center of Jiangsu Province,Nanjing 210029，China）

We intend to hydrolyze the meat residue of Mactra veneriform is to prepare antioxidative pep tides for complete utilization of the bioresources.For that，an applicative hydrolase was chose in four proteases(trypsin，pepsin，papain and neutral proteinase)by comparing the antioxidant activity of hydrolysates.After having selected trypsin as hydrolase，a single factor experiments with radicals scavenging as index were preliminary carried to determine the optimum using conditions including the enzyme addition，hydrolysis temperature，time and pH.Moreover，orthogonal process test was also used to confirm the optimum hydrolysis process.Results from the process tests showed that it could obtain the strongest antioxidative hydrolysates under using 0.5%trypsin to hydrolysis 90m in at 45°C，pH=8.5 conditions.The enzymetic hydrolysis process of c lam meat residue could provide a research basis for the study of antioxidative peptides.

Mactra veneriformis；enzymolysis；antioxidative activity；peptides

TS254.1

B

1002-0306（2011）10-0285-04

2011－04－06 * 通訊聯(lián)系人

王令充（1979-），男，博士，助研，主要從事天然生物大分子研究。

江蘇省中醫(yī)藥管理局科技項目（LZ09023）；國家自然科學(xué)基金項目（30900293）；國家海洋公益性行業(yè)科研專項（200705009）。