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        喜樹堿含量的測定方法研究

        2011-10-13 03:24:08方旭東陳紹宇
        天津化工 2011年2期
        關(guān)鍵詞:點樣喜樹堿展開劑

        方旭東,陳紹宇

        (1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院,天津300402;2.廣西欽州市水利電力勘測設(shè)計院,廣西欽州535000)

        喜樹堿含量的測定方法研究

        方旭東1,陳紹宇2

        (1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院,天津300402;2.廣西欽州市水利電力勘測設(shè)計院,廣西欽州535000)

        本文介紹了喜樹堿含量的分析測定方法。樣品采用了乙醇超聲提取法從喜樹葉中提取喜樹堿,并用薄層層析法和高效液相色譜法分析測定喜樹堿的含量。薄層層析法測定喜樹堿的含量使用硅膠G做固定相,v(氯仿):v(丙酮)=70∶30、v(甲醇)∶v(氯仿)=10∶90做展開劑。高效液相色譜法用v(甲醇)∶v(水)=55∶45做流動相,并且流動相流速為1.0mL/min。在波長為254 nm,溫度為25℃下檢測。每次進(jìn)樣量為5μL。

        喜樹堿;高效液相色譜;薄層層析;分析測定方法

        目前,農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性以及作物藥害等農(nóng)藥產(chǎn)生的副作用,是我們需解決的問題之一。生物農(nóng)藥采用天然產(chǎn)物,對人類、環(huán)境和作物是低毒、無毒且殘留時間較短的。喜樹堿是一種具有生物活性可廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)藥的物質(zhì),本文利用薄層層析(TLC)法和高效液相色譜(HPLC)法對喜樹葉中提取的喜樹堿含量進(jìn)行了分析與測定。該法簡便、快捷、準(zhǔn)確性高,為將來該領(lǐng)域研究提供了可靠的依據(jù)。

        1 實驗儀器、試劑與材料

        1.1 實驗儀器

        高效液相儀、紫外光檢測器、色譜工作站、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高速離心機(jī)、電子天平。

        1.2 實驗試劑

        甲醇,95%乙醇,無水乙醇,丙酮,氯仿,硅膠G(薄板層析用)。

        1.3 植物材料

        喜樹葉于2010年8月采自欽州市水利局喜樹園栽培3年生的喜樹幼苗,采集喜樹嫩葉(頂芽,頂芽以下1~2片葉)。

        用天平稱取采得的喜樹葉約1000 g,并用自來水將其洗凈后置于恒溫干燥箱內(nèi),調(diào)整恒溫干燥箱溫度至40℃烘干24 h,直到材料發(fā)脆,再用60目的DWF-TOOA型粉碎機(jī)粉碎,將粉碎好的喜樹葉裝入密封袋后將其置于4℃冰箱中避光保存,待用。

        用電子天平精確稱取已經(jīng)烘干及粉碎過的干燥喜樹葉(60目)1.000 g置于25mL容量瓶中,向25mL容量瓶中加入95%乙醇16mL進(jìn)行超聲提取4min后,將其取出并冷卻至室溫,再用LG10—2.4A高速離心機(jī)進(jìn)行離心處理,最后用乙醇定容,待用[1]。

        2 喜樹堿含量分析測定方法

        2.1 TLC法[2~4]

        2.1.1薄層板的制備

        用電子天平精確稱取6.3 g硅膠G(在硅膠中加入12%~14%作為粘合劑的石膏)將硅膠G與1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)調(diào)和成勻漿。用手動將已調(diào)制好的固定相均勻地涂鋪在20 cm×5 cm玻璃板上。將鋪好的薄板水平放置,室溫下晾干,然后將其放入干燥器中,在110℃下活化0.5 h后在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.1.2點樣

        用0.25mm點樣毛細(xì)管吸取用乙醇超聲法提取的提取液,輕輕垂直接觸于點樣線上(點樣線即距離薄層板底邊1~2 cm處),反復(fù)點樣15次,每次點樣必須在上一次點樣干燥后再點。要求點樣直徑不超過2~3mm。

        2.1.3展開

        層析前將展開劑[展開劑用v(氯仿)∶v(丙酮)=70∶30、v(甲醇)∶v(氯仿)=10∶90]倒入層析缸中,讓展開劑揮發(fā)使層析缸中氣體達(dá)到飽和狀態(tài),將制好的薄層板并點有樣品的一端浸在展開劑中,選用直立上行法展開,層析,完畢后取出薄層板并用鉛筆標(biāo)明溶劑前沿。

        2.1.4定位

        由于喜樹堿對多種生物檢測試劑均呈負(fù)反應(yīng),但在紫外光下有明顯的藍(lán)色熒光,因此,本試驗將薄層板放入暗室中用紫外光來照射,使薄層板上的斑點顯現(xiàn)出來從而檢測樣品中是否有喜樹堿存在。

        2.1.5定性

        TLC法定性主要依據(jù)的是組分斑點的比移值Rf=該組分斑點到原點的距離/溶劑前沿至原點的距離。

        2.1.6定量

        將薄層板上的樣斑取下,溶解,再用分光光度法測定。

        2.2 HPLC法[5~7]

        Waters600高效液相儀,Waters600泵,Waters 486型紫外光檢測器;echsphereODS柱(25cm×4.6 mmID,5μm),流動相為v(甲醇)∶v(水)=55∶45,流速1.0mL·min-1,檢測波長254nm,柱溫25℃,進(jìn)樣量5μL;按照面積外標(biāo)法計算。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 薄層層析法分析

        根據(jù)溶劑前沿和喜樹堿斑點移動的距離,可以算出喜樹堿在氯仿/丙酮展開劑中的比移值Rf(溶質(zhì)移動距離與流動相移動距離之比)約為0.6;在甲醇/氯仿展開劑中的比移值Rf約為0.80。

        3.2 高效液相色譜法分析條件[8~12]

        3.2.1檢測波長的確定

        喜樹堿在254nm處有最強(qiáng)吸收,大量研究也以254nm作為喜樹堿的檢測波長,因此,本試驗采用254nm作為紫外檢測器的檢測波長。

        3.2.2流動相的選擇

        乙腈/水、甲醇/水是高效液相色譜常用的流動相,但考慮到乙腈的毒性較大、成本高,且喜樹堿溶于甲醇,所以選擇甲醇/水作為流動相。因此,本試驗選用流動相,v(甲醇)∶v(水)=55∶45,流速1.0mL·min-1,檢測波長254nm,柱溫25℃。在此條件下,喜樹堿的保留時間適中,峰形良好,出峰時間7.5min左右。

        3.2.3喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        用電子天平精確稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品5.2mg于100mL容量瓶,以100%乙醇為溶劑,超聲溶解并定容至刻度,作為對照品溶液。精確吸取對照品溶液0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL置于10mL的容量瓶中,用100%的乙醇溶液分別稀釋定容至刻度,搖勻。按照上述色譜條件,分別進(jìn)樣分析,每個樣品重復(fù)測定3次,分別取峰面積的平均值。標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖見圖1。以峰面積為縱坐標(biāo),喜樹堿溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見圖2),進(jìn)行線性回歸,得峰面積(Y)與喜樹堿濃度(X)一元線性回歸方程:y=6.0×10-5X-2.321,R2=0.998,線性范圍:3.00~44.83mg·L-1。

        根據(jù)方程可得喜樹堿提取率的計算公式如下:

        提取率‰=(濃度×體積×10-6/樣品質(zhì)量)×103

        圖1 喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

        圖2 喜樹堿濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

        3.2.4精密度測定

        按照3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件,取同一濃度的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣,每次進(jìn)樣5μL。精密度測定當(dāng)峰面積分別為:729347.9和782139.250時,標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為:8425.4和7604.1,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為:1.16%和1.01%,可見標(biāo)準(zhǔn)偏差為7604.1,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為1.01%時,標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均很小,表明試驗結(jié)果精密度良好。

        3.2.5儀器穩(wěn)定性試驗

        按照3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件,取同一濃度的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別于2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h測定其峰面積,每次進(jìn)樣5μL,重復(fù)操作三次。

        求得標(biāo)準(zhǔn)偏差為152129.90,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.76%,見表1,標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小,表明儀器的穩(wěn)定性較好,試驗數(shù)據(jù)精確,結(jié)果可靠。

        表1 儀器穩(wěn)定性測定結(jié)果

        3.2.6重現(xiàn)性試驗

        用電子天平精確稱取同一樣品5份,每份1.000 g采用乙醇超聲法提?。阂掖己?0%,超聲提取時間4min。按3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件進(jìn)行喜樹堿含量的測定,每個樣品重復(fù)測量3次。

        測得標(biāo)準(zhǔn)偏差為86842.3,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%(見表2),表明本試驗的重現(xiàn)性較好。

        表2 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

        3.2.7回收率的測定

        精確稱取同一樣品5份,采用乙醇超聲法提取,乙醇含量60%,超聲提取時間4min。向提取液中分別加入52mg/L的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液10mL,按3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件測定喜樹堿含量,計算回收率。

        回收率(%)=[(加標(biāo)樣后喜樹堿含量-樣品中喜樹堿含量)/加入標(biāo)樣量]×100%

        表3 回收率試驗結(jié)果

        可見,平均回收率較高,為96.154,且標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小,表明以該方法提取喜樹堿結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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        10.3969/j.issn.1008-1267.2011.02.019

        TQ450.7

        A

        1008-1267(2011)02-0046-04

        2010-11-04

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