李 璐，高艷鋒，祁元明

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001

(2010-02-10收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

近年來(lái)，腫瘤的免疫治療發(fā)展很快，它以提高患者機(jī)體免疫力為基礎(chǔ)，以誘發(fā)體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)為手段，在腫瘤的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要的作用［1-3］。HLA-Ⅰ類分子限制性抗原表位肽因能誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞而受到廣泛關(guān)注［4-5］。妊娠期特異性 beta1糖蛋白 9(pregnancy specific beta1 glycoprotein 9，PSG9)是近年發(fā)現(xiàn)的在結(jié)直腸癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的一個(gè)蛋白，屬于癌胚抗原(CEA)/PSG家族中的一員［6］，目前尚未見(jiàn)其HLA-Ⅰ類限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位肽的報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn)PSG9在食管癌細(xì)胞中是一種高表達(dá)的抗原，另外，在我國(guó)有52.7%的人群表達(dá)HLA-A3，因此尋找來(lái)源于PSG9的HLA-A3限制性CTL優(yōu)勢(shì)表位，在食管癌的免疫學(xué)治療方面均有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 T2A3細(xì)胞由耶魯大學(xué)Cresswell教授惠贈(zèng)，EC-1細(xì)胞為鄭州大學(xué)生物工程系多肽生化實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)來(lái)自HLA-A3+的健康捐贈(zèng)者。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及EC-1細(xì)胞PSG9 mRNA檢測(cè)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) T2A3、EC-1(HLA-A3+)、EC-109(HLA-A3+)和EC9706(HLA-A3－)細(xì)胞以及人PBMCs，采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件，均為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度，常規(guī)傳代。

1.2.2 食管癌細(xì)胞系PSG9 mRNA檢測(cè) 采用RTPCR法檢測(cè) PSG9 mRNA在食管癌細(xì)胞 EC9706、EC-1和EC-109中的表達(dá)情況。PSG9引物序列:上游 5’-GCTTCGGGAGGAGATTCAGGG-3’，下游 5’-TTCATTCACCTATTACCGTTCAGGAGA-3’，產(chǎn)物大小349 bp(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.3 HLA-A3限制性CTL表位的預(yù)測(cè)與構(gòu)建

1.3.1 表位預(yù)測(cè) 首先運(yùn)用 Syfpeithi和 Bimas數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行表位與HLA-Ⅰ類分子的親和力分析，再運(yùn)用NetCTL 1.2數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行針對(duì)表位的HLA-A3超型的結(jié)合力、蛋白酶體酶切位點(diǎn)及TAP提呈可能性等的綜合預(yù)測(cè)分析。

1.3.2 肽的合成、純化、分析及鑒定 候選肽采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成，經(jīng)HPLC純化后，其純度＞95%，質(zhì)譜分析證實(shí)其相對(duì)分子質(zhì)量符合理論值。

1.4 構(gòu)建表位的抗原性及免疫原性檢測(cè)

1.4.1 表位肽/HLA-A3分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn) T2A3細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸至1×109L－1，加入待測(cè)肽(50 mg/L)和 β2微球蛋白(β2-M，3 mg/L)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2共孵育18～24 h后，冷PBA洗滌3次，加100μL稀釋度為1∶100的一抗(鼠抗人β2-M)，4℃放置30 min。冷PBA洗滌3次后，加50μL稀釋度為1∶50的二抗(FITC-羊抗鼠IgG溶液)，4℃放置40 min，洗滌后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果用熒光系數(shù)(FI)表示:FI=(表位肽熒光強(qiáng)度－背景熒光強(qiáng)度)/背景熒光強(qiáng)度。FI＞1.0表示具有高結(jié)合力，0.5～1.0表示具有中等結(jié)合力，＜0.5表示結(jié)合力弱。

1.4.2 效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的制備 HLA-A*1101/HLA-A*2601(HLA-A3+)陽(yáng)性健康人的濃縮白細(xì)胞經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲得PBMCs，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109L－1。第2天分別加入不同濃度的待測(cè)肽共培養(yǎng)。第3天加入5×104U/L的rhIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，90 g離心10 min，去除上清，加入新鮮培養(yǎng)基，補(bǔ)足等量的待測(cè)肽以及rhIL-2，繼續(xù)培養(yǎng)。刺激3輪，于最后一輪刺激3 d后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。胰蛋白酶消化腫瘤細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸至所需細(xì)胞濃度。

1.4.3 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 收集CTL，100 g離心10 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×109L－1;調(diào)節(jié)EC-1細(xì)胞濃度為1×108L－1，5 000 個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，每孔終體積為100μL。37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入裂解液。250 g離心4 min。轉(zhuǎn)移50μL上清至另一96孔板中;加入50μL/孔稀釋后的底物混合液，室溫避光孵育30 min;加入50μL/孔終止液;去除氣泡，1 h內(nèi)在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A值)。殺傷率=(實(shí)驗(yàn)孔A值－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值－CTL自發(fā)釋放A值)/(靶細(xì)胞A值－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 PSG9 mRNA在食管癌細(xì)胞EC-1中表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 EC-1細(xì)胞PSG9 mRNA的表達(dá)A:PSG9;B:內(nèi)參GAPDH;M:Marker;1:EC9706細(xì)胞;2:EC-1細(xì)胞;3:EC-109細(xì)胞。

2.2 PSG9 HLA-A3限制性表位的預(yù)測(cè) 將Syfpeithi和Bimas分別預(yù)測(cè)得到分值較高的抗原表位，再結(jié)合NetCTL 1.2預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，獲取4條評(píng)分顯著高于其他的CTL表位，分別為:P107、P201、P336和P378。對(duì)P2、P9位氨基酸殘基進(jìn)行替換后通過(guò)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合預(yù)測(cè)，獲得2條分值較高的改造肽，分別為:P336-2L9K和P378-9K(表1)。

2.3 表位肽/HLA-A3分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果P107、P201和P336-2L9K 具有弱結(jié)合力(FI＜0.5)，P336、P378和P378-9K 具有中等結(jié)合力(FI＞0.5)，見(jiàn)表1。

2.4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果 P336、P336-2L9K、P378和P378-9K 4條候選表位誘導(dǎo)得到的CTL對(duì)于PSG9表達(dá)陽(yáng)性的食管癌細(xì)胞EC-1(HLA-A3+)的殺傷情況見(jiàn)圖2。P336、P336-2L9K、P378和 P378-9K 4條候選表位誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比40∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別是(15.8±1.2)%、(35.5±10.7)%、(26.9 ±4.3)%和(36.7 ±2.8)%;而不加抗原刺激的T細(xì)胞在效靶比40∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞殺傷率是(5.1 ±1.9)%。

表1 PSG9 HLA-A3限制性表位預(yù)測(cè)和結(jié)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 P336、P336-2L9K、P378和P378-9K誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞EC-1的殺傷情況A ～ E:分別為陰性對(duì)照、P336、P336-2L9K、P378和 P 378-9K。

3 討論

該研究中作者鑒定了來(lái)源于PSG9的4條候選表位和2條改造后的表位，理想的表位不僅需要一定的抗原性，也需要一定的免疫原性［7］。通過(guò)Bimas、Syfpeithi［8］和 NetCTL 1.2［9］這 3 種數(shù)據(jù)庫(kù)，以及T2A3細(xì)胞結(jié)合力實(shí)驗(yàn)評(píng)估候選表位的抗原性;再通過(guò)體外誘導(dǎo)CTL反應(yīng)評(píng)估候選表位的免疫原性。

針對(duì)2位和9位這2個(gè)MHC類分子與九肽的主要錨定位點(diǎn)進(jìn)行改造［10］可以提高九肽與HLA-Ⅰ類分子的親和力，有報(bào)道［11］顯示改造肽相對(duì)于原肽誘導(dǎo)CTL殺傷的能力也有所提高。在該研究中，改造肽與T2A3細(xì)胞表面的HLA-Ⅰ類分子的親和力與原肽相比并沒(méi)有明顯的提高，但改造肽刺激PBMCs得到的CTL對(duì)于表達(dá)PSG9的EC-1細(xì)胞的殺傷率均高于原肽。可能的原因是改造肽相對(duì)于原肽能與HLA-Ⅰ類分子形成更穩(wěn)定的復(fù)合物，作者將進(jìn)行下一步研究進(jìn)行驗(yàn)證。

PSG9蛋白是一種CEA，也是一種腫瘤過(guò)表達(dá)抗原，在結(jié)腸癌組織中 mRNA水平的表達(dá)率是78%［6］，但在胚胎組織中也會(huì)有一定量的表達(dá)。在胚胎發(fā)育時(shí)期，來(lái)源于自身抗原的表位肽被MHC分子提呈后給TCR識(shí)別，因此當(dāng)表位肽/MHC分子復(fù)合物結(jié)合到高親和力的TCR時(shí)，表達(dá)該TCR的T細(xì)胞就會(huì)被克隆刪除，以保證機(jī)體不會(huì)對(duì)自身成分產(chǎn)生應(yīng)答。選擇高親和力的表位肽作為疫苗，機(jī)體將可能表現(xiàn)出對(duì)該表位肽的免疫耐受，成為CTL發(fā)揮抗腫瘤作用的最大障礙［12］。而基于低親和力表位設(shè)計(jì)的抗腫瘤疫苗更有可能在體內(nèi)成功招募特異性CTL，因此低親和力表位也可以作為抗腫瘤疫苗的候選表位。該研究中作者的候選表位均為低親和力或中等親和力的表位，具有一定的抗原性的同時(shí)降低了機(jī)體出現(xiàn)對(duì)表位肽免疫耐受的可能。

該研究鑒定出3條新表位 P378、P378-9K和P336-2L9K，體外刺激 PBMCs均能誘導(dǎo)出較高的CTL活性，有效地殺傷表達(dá)PSG9的EC-1細(xì)胞。該結(jié)論為基于PSG9的抗腫瘤多肽疫苗的進(jìn)一步體內(nèi)研究以及臨床研究提供了依據(jù)。

［1］ Tang Y，Lin Z，Ni B，et al.An altered peptide ligand for naive cytotoxic T lymphocyte epitope of TRP-2(180-188)enhanced immunogenicity［J］.Cancer Immunol Immunother，2007，56(3):319

［2］ Lv Y，Ruan Z，Wang L，et al.Identification of a novel conserved HLA-A*0201-restricted epitope from the spike protein of SARS-CoV［J］.BMC Immunol，2009，10:61

［3］方芳，宋獻(xiàn)美，張慶勇，等.人 MUC1和鼠Muc1蛋白疫苗抗腫瘤作用的比較［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，36(1):114

［4］ Wenandy L，Sфrensen RB，Sengelфv L，et al.The immunogenicity of the hTERT540-548 peptide in cancer［J］.Clin Cancer Res，2008，14(1):4

［5］ Groeper C，Gambazzi F，Zajac P，et al.Cancer/testis antigen expression and specific cytotoxic T lymphocyte responses in non small cell lung cancer［J］.Int J Cancer，2007，120(2):337

［6］ Salahshor S，Goncalves J，Chetty R，et al.Differential gene expression profile reveals deregulation of pregnancy specific beta1 glycoprotein 9 early during colorectal carcinogenesis［J］.BMC Cancer，2005，5:66

［7］Guo YJ，Wang KY，Sun SH.Identification of an HLA-A*0201-restricted CD8(+)T-cell epitope encoded within Leptospiral immunoglobulin-like protein A［J］.Microbes Infect，2010，12(5):364

［8］呂虹，高艷鋒，祁元明.結(jié)核桿菌抗原 CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測(cè)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，45(1):73

［9］ Larsen MV，Lundegaard C，Lamberth K，et al.Largescale validation of methods for cytotoxic T-lymphocyte epitope prediction［J］.BMC Bioinformatics，2007，8:424

［10］Lazoura E，Apostolopoulos V.Rational peptide-based vaccine design for cancer immunotherapeutic applications［J］.Curr Med Chem，2005，12(6):629

［11］Li F，Yang D，Wang Y，et al.Identification and modification of an HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from Ran antigen［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(12):2039

［12］楊曌，王莉.低親和力CTL表位肽在治療性腫瘤疫苗中應(yīng)用的研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15(7):1007